α-淀粉酶發酵生產影響因素的研究進展

王紹輝，崔志峰

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州310032)

α-淀粉酶發酵生產影響因素的研究進展

王紹輝，崔志峰*

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州310032)

α-淀粉酶作為一種重要的工業酶制劑，在工業生產中應用十分廣泛。對近年來報道的有關溫度、pH、碳氮源、金屬離子、微量元素、溶氧、發酵工藝等影響α-淀粉酶發酵生產的各種因素進行了綜述，旨在為指導α-淀粉酶的工業生產和進一步提高生產效率提供參考。

α-淀粉酶，碳氮源，金屬離子，微量元素，發酵工藝

1 培養基成分對發酵生產的影響

1.1 碳氮源對發酵生產的影響

在α-淀粉酶發酵生產中常用的碳源為可溶性淀粉或生淀粉，常用的氮源有酵母提取物、大豆粉、肉汁提取物、蛋白胨等。但是，從工業能耗和生產成本考慮，越來越多的生產廠家開始用一些低成本又能提供良好碳氮源的農業廢料如麩皮、油餅來替代成本較高的可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨等精細碳氮源。盡管麩皮等殘料在顆粒大小、碳氮比例上參差不齊，同時這類殘料含有一些未知的雜質，然而這些替代品不但能提供豐富的營養，而且成本十分低廉，經過研究和優化可以成為良好的碳氮源。

利用低成本的農業原料將是以后大規模發酵生產的趨勢。Saban［5］等研究 Bacillus amyloliquefaciens NRRL-645利用蓖麻油餅發酵生產α-淀粉酶時，用響應面法對固體發酵過程中蓖麻油餅、蛋白胨、酵母提取物和(NH4)2SO4進行了優化，當蓖麻油餅、蛋白胨、酵母提取物、(NH4)2SO4的含量分別為22.62、5.20、1.62、6.81g/L時，α-淀粉酶產量可達到最高為4895U;而在實際培養中產量達到了4827U，與優化前相比提高了8%。

Rajagopalan［6］等以農業廢料作為碳氮源，利用一株枯草芽孢桿菌KCC103進行α-淀粉酶的深層液體發酵生產。實驗首先對一系列可以作為碳源的麥麩、甘蔗渣、米糠和麥桿等農業廢料作了調查，發現利用麥麩生產α-淀粉酶產量最高，這與麥麩含有大量的碳水化合物和蛋白質有關。實驗還對適合作為氮源的太陽花油餅、蓖麻油餅、棉籽油餅、芝麻油餅和花生油餅進行了分析，其中太陽花油餅最適合枯草芽孢桿菌KCC103進行α-淀粉酶生產。實驗將麥麩和太陽花油餅以1∶1進行混合發酵得到了較高的α-淀粉酶產量(90U/mL)。根據響應面法對培養基進行優化后產量進一步提高，當將麥麩和太陽花油餅以1.27%和1.42%進行混合發酵時，產量比原來提高了14倍，達到1258U/mL。

在固態發酵生產α-淀粉酶時，麩皮作為廉價的農業加工產品的廢棄物是十分常用的替代碳源。劉仲敏［7］等在研究米曲霉ZLF13固態發酵時發現麩皮中淀粉的含量會影響到最終α-淀粉酶的產量。在培養基滅菌后，淀粉含量少的麩皮不易粘成團，有利于通氣，但是碳氮比較低;而淀粉含量過高的麩皮滅菌后易粘成團，影響通氣性，而且粘團內部的淀粉也不利于菌絲的利用吸收。通過實驗發現，出粉率在60%左右的麩皮最適合用于米曲霉ZLF13生產α-淀粉酶，在這種生產條件下得到的α-淀粉酶的酶活最高，在中試中平均酶活可達到1283U/g。

1.2 金屬離子和其他無機離子對發酵生產的影響

α-淀粉酶是一種金屬酶，在發酵過程中適當地加入一些金屬離子對于α-淀粉酶的產量有一定的促進作用。Gupta等曾對一些金屬離子的影響作過綜述，常見的金屬離子如K+、Fe2+、Mo2+、Cl-等對于α-淀粉酶的產量基本沒有影響;Mg2+則對產量起著關鍵的作用，在沒有添加Mg2+的情況下產酶量會下降50%;Mn2+對于產量也會有一定的促進作用;而Co2+可以使菌體量大大增加但是會導致產量有一定的下降［8］。Dhanya［9］等用 Box-Behnken理論對Bacillus amyloliquefaciens利用麥麩和花生油餅深層液體發酵生產α-淀粉酶進行優化時發現，培養時間和CaCl2濃度對發酵結果起決定作用。當培養時間和CaCl2濃度分別為42h和0.0275mol/L時產酶量達到最高。其他無機離子對于α-淀粉酶發酵生產也有影響，如Ueno等［10］發現在利用Aspergillus oryzae生產α-淀粉酶過程中磷酸鹽對于初期的產酶和后續的次級代謝有十分重要的調控作用，研究發現，在磷酸鹽的濃度超過0.2mol/L時菌體數和酶的產量都有提高，而低于這個濃度時細胞密度和產酶量都有明顯下降，但是在高濃度的磷酸鹽培養基中，產酶量嚴重下降。

1.3 生長因子對發酵生產的影響

Rajagopalan［11］等在研究利用 Bacillus subtilis KCC103進行發酵生產時發現一些微量的生長因子對于產量有著重要的影響。有些氨基酸如組氨酸、纈氨酸、賴氨酸和酪氨酸對酶的產量起阻礙作用，而添加了0.03%的半胱氨酸后，產量增加了2倍。B族維生素添加到培養基后產量也有明顯提高，影響最大的是維生素B1和B6，當添加0.02%的維生素B1后，產量提高2.35倍。一些表面活性劑對產量也有一定的影響，如SDS對產量起促進作用，而其他的表面活性劑如吐溫20、吐溫-80等都對產量起阻礙作用。他們對上述因子進行了優化，在3%生土豆、2%酵母提取物、0.03%半胱氨酸、0.02%維生素 B1、0.02%SDS和0.5mmol/L MgSO4培養基中，36～48h后酶活最大為 537.7U/mL。Prakasham［12］等在研究Aspergillums awamori生產酸性α-淀粉酶的影響因素時發現，除了底物濃度和pH對酶產量的影響外，酪蛋白和MgSO4對于α-淀粉酶產量也有明顯的影響，在0.125%MgSO4和1.5%酪蛋白條件下，酶產量最高。

2 發酵條件的影響

2.1 溫度的影響

溫度在微生物的生長和代謝過程中起著至關重要的作用。一般用于工業生產α-淀粉酶的菌株多為絲狀真菌和芽孢桿菌。多數生產α-淀粉酶的絲狀真菌最佳生長溫度為25～37℃，一些生產耐高溫α-淀 粉 酶 的 真 菌，如 Talaromycesemersonii、Thermomonspora fusca和 Thermomyces lanuginosus等最適溫度在50～55℃;生產α-淀粉酶的芽孢桿菌，如Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和Bacillus stearothermophilus的最適生長溫度在37～60℃，一些產超耐熱α-淀粉酶的細菌如Thermococcus profundus和 Thermatoga maritima的最佳生長溫度是 80℃［1］。一株工 程菌 Bacillus licheniformis NH1的最適溫度在37℃［13］，在一些產特殊性質α-淀粉酶的細菌中，它們對溫度的要求更加苛刻，如一株產耐冷α-淀粉酶的細菌的最適溫度為4℃［8］。

2.2 pH的影響

pH在生產過程中是十分重要的參數。而且隨著發酵的進行，一些代謝物的釋放會改變最初的生長pH，這種變化同時也會對產物的穩定性造成一定影響。通常真菌喜歡偏酸性的生產環境，而細菌在中性環境下生長較好。經研究發現一些曲霉屬的真菌如 Asperjillus oryzae、Asperjillus ficuum、和 Asperjillus niger在液體深層發酵過程中，當 pH在5.0～6.0時α-淀粉酶產量最高［14-16］。而細菌如Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和 Bacillus stearothermophilus需要的起始pH為7.0［1］。一些產耐酸性α-淀粉酶的細菌則需要在一個相對偏酸性的環境下才能達到最大產量，如Thermococcus profundus在pH4.5時產酶量最高［17］。Prakasham［12］等在研究Aspergillums awamori生產酸性α-淀粉酶的影響因素時發現，pH4.0時酶產量最高。

2.3 溶氧的影響

在一些耐高溫α-淀粉酶的生產過程中，生產菌株在對數期時強烈需氧，這一時期的供氧量成為菌體生長的限制性因子，對于后來的產酶量有直接影響。林劍［18］等通過對一株α-淀粉酶生產菌株IIY-1液體發酵的研究發現，在對數期需要大量的溶氧，過了對數期后對氧氣的需求仍較大，保證對數期后的產酶階段溶氧不低于10%對于該菌株的耐高溫α-淀粉酶發酵順利進行仍然是很重要的。在固態發酵中，Rahardjo等通過研究A.oryzae CBS570.64在低溶氧情況下的生長狀態發現，當溶氧在1%時，菌絲生長緩慢，當降至0.25%時，菌絲的生長明顯受限，同時發酵產物的產量嚴重下降;當溶氧升至21%時，菌絲生長迅速且發酵產物量也大大增加［19］。

3 結論與展望

α-淀粉酶在工業生產中應用十分廣泛。隨著人類對工業能耗的關注和重視，采用低廉的生物加工廢料和高效的加工工藝將是今后生產α-淀粉酶的首選方法。但是，α-淀粉酶發酵生產的影響因素很多，尤其是利用低廉的生物加工廢料進行生產時影響因素更加復雜。除此之外，接種方式、生產工藝流程等也會對產量有很大影響。尹源明等［20］通過添加氧載體正十二烷提高發酵體系的氧氣傳遞速率從而促進了發酵體系的產酶能力。在批量生產過程中接種的方式對結果也有很大的影響，Tari和Milner［21］等研究發現兩步接種法比一步法的產酶量要高。細胞的固定化技術也被應用于α-淀粉酶的生產過程中，Konsoula［22］等將2%海藻酸鈣和3.5%CaCl2用于包埋地衣芽孢桿菌進行α-淀粉酶的固定化生產，使產酶量提高了176%。因此，α-淀粉酶發酵生產的影響因素與酶產量之間有直接關系。對α-淀粉酶發酵生產的影響因素進行研究和優化，有利于進一步降低α-淀粉酶發酵生產成本，提高生產效率，促進α-淀粉酶發酵工業的發展。

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Research progress in influencing factors of fermentation conditions of α-amylase

WANG Shao-hui，CUI Zhi-feng*
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China)

α-amylase has a broad spectrum of industrial applications as an industrial enzyme.In this review，factors that influence fermentation of α-amylase including temperature，pH，mental ions，trace elements，nitrogen and carbon sources，concentration of dissolved oxygen and fermentation process were summarized.

α-amylase;carbon and nitrogen sources;mental ions;trace elements;fermentation process

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0456-03

α-淀粉酶的系統命名為α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.1)，是重要的工業酶制劑，可以隨機切斷直鏈淀粉或支鏈淀粉中相鄰的α-1，4-糖苷鍵、將淀粉水解為糊精和一系列以葡萄糖為組成單位的低聚糖［1］。α-淀粉酶最早在 1811年由Kirchhoff發現，它廣泛分布于微生物、植物和動物，但淀粉酶生產菌株主要來源于真菌和細菌，如Asperjillus aryzae、Bacillus subtilis、Bacilluss licheniformis等［2］。α-淀粉酶在現代工業生產中廣泛應用于酒精釀造、淀粉深加工、焙烤工業、啤酒釀造、紡織和醫藥工業［3-4］。由于利用α-淀粉酶進行工業生產可以縮短生產周期、提高產品得率和原料利用率、減少能耗，越來越引起人們的關注。目前，工業上生產α-淀粉酶主要是通過微生物發酵的方法，其中可以分為固態發酵(SSF)和深層液體發酵(SmF)。固體發酵是一種培養基呈固態、利用自然底物作為碳氮源的發酵方法，對設備的要求較低。深層液體發酵相比于固體發酵方法有許多優點:先進的生產工藝，大大提高了底物的利用率;生產周期短，質量穩定;機械化生產，提高了勞動生產率。在工業生產中，發酵條件對α-淀粉酶產量有重要的影響。本文通過對近年來α-淀粉酶生產中的各種影響因素及優化的研究成果進行綜述，旨在為進一步提高α-淀粉酶生產效率提供參考。

2010-02-08 *通訊聯系人

王紹輝(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:生物技術。