2型糖尿病患者外周血內皮祖細胞體外誘導培養及黃芪多糖干預研究*

徐寒松 吳 青 謝曉云 孔德明 貴陽中醫學院第二附屬醫院內分泌科 (貴陽 550003)

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂綜合征。其慢性并發癥嚴重影響患者生活質量,是糖尿病患者致殘致死的主要原因。糖尿病慢性并發癥基礎的病理改變主要是微血管病變和大血管病變,EPCs參與出生后血管新生和內皮損傷后的修復過程[1],因此,EPCs可作為組織工程中血管的種子細胞來源。但 EPCs在正常人骨髓及外周血循環中數量較少,研究結果顯示,從人外周血單個核細胞中分離出來的EPCs僅為 0.05%～ 0.1%[2]。其培養方法復雜,成本較高,給其研究帶來不便。本研究在 EPCs的培養中以自行制備的鼠尾膠原代替昂貴的纖維連接蛋白,并觀察其培養細胞的效果,期望以最低的花費獲得能構建組織工程血管的足夠的種子細胞。我們的前期研究證實黃芪能促進正常及糖尿病條件下 EPCs的增殖和分化[3,4],黃芪多糖(APS)是黃芪的主要活性物質,具有保護胰島β細胞、調節血糖及改善脂代謝和胰島素抵抗的作用[5～11],但其對 EPCs的影響目前未見報道。本研究通過觀察APS對 T2DM外周血 EPCs增殖的影響,探討黃芪多糖在糖尿病血管并發癥治療中的可能機制。

1 材 料

1.1 標本 T2DM的診斷參照 1999年 W HO診斷標準。T2DM患者(T2DM組)及健康人組 (Con組)各 20例,均來自中南大學湘雅醫院,T2DM組為內分泌科住院患者,入選患者無他汀類藥物降脂治療史。Con組為體檢中心經體檢健康者。采集空腹外周血 30mL/例,均獲得獻血者知情同意。所有獻血者均排除炎癥、近期外傷、手術史、皮膚潰瘍、心血管、血液系統疾病等影響 EPCs的因素。Con組的血標本不進行任何干預,僅做正常對照。

1.2 藥物與試劑 M 199培基 (Hyclone),胎牛血清(Gibco),VEGF、bFGF(PeproTech),人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物),FITC-U EA-1、Dil-acLDL(Sigma),黃芪多糖粉針劑(天津賽諾制藥有限公司,國藥準字:Z20040086,批號:080901,每支 250mg),M T T、DM SO、胰蛋白酶 (Amresco),PE直標鼠抗人 CD133、FITC直標鼠抗人 CD34單克隆抗體、KDR單克隆抗體(R&D SYSTEMS),健康 SD大鼠購自中南大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 鼠尾膠原的制備 水合氯醛腹腔注射麻醉 SD大鼠后,剪下鼠尾浸泡在 75%酒精中 30min后,在無菌雙蒸水中反復沖洗 2～ 3次,在超凈臺內將鼠尾剪成小段,抽出尾腱置平皿中,盡可能剪碎,將剪碎的肌腱浸入 0.1%無菌醋酸中(每 1g尾腱加入 50mL的 0.1%無菌醋酸),置 4℃冰箱中振搖 48～ 72h,使肌腱充分溶解成為膠原溶液。再移入無菌離心管內 4000r/min離心 30min,取上清液分裝入無菌小瓶,-20℃保存備用?？梢岳^續向離心后的沉淀中加入適量醋酸,重復以上步驟,以制備更多的鼠尾膠原。

2.2 EPCs的分離、培養 密度梯度離心法獲取 T2DM患者與健康人外周血單個核細胞,各用 5mLM199培養基(含20%胎牛血清、VEGF12ng/mL、bFGF4ng/mL、青霉素 100U/mL、鏈霉素 100U/mL)重懸,加到鼠尾膠原預包被的培養瓶內,4d后首次換液,以后隔日換液培養至 7d,收集貼壁細胞供實驗用。

2.3 EPCs的鑒定 細胞與 Dil-acLDL及 FITC-UEA-1孵育后,激光共聚焦顯微鏡鑒定 EPCs;流式細胞儀檢測 EPCs表面抗原標志,Cell Quest軟件定量分析每管樣品中 10000個細胞,分析 CD34、CD133和 KDR的陽性表達百分率。

2.4 M T T實驗觀察黃芪多糖對 T2DM EPCs的影響以健康人 EPCs做為對照,用含不同濃度黃芪多糖組的 M199培養基 (黃芪多 糖終濃度分 別為 0、 50mg/l、 200mg/l、 800mg/l、3200mg/l、6400mg/l)干預 T2DM患者 EPCs,分別培養 6、12、24、48h。取 490nm波長,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(A值),記錄結果。

3 統計學方法 用 SPSS 17.0統計軟件包進行數據處理,計量資料以(±s)表示 ,各組間均數比較采用 ANOV A分析,P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結 果

4.1 臨床資料比較 T2DM組和 Con組在性別、年齡、吸煙、血脂方面無統計學差異(P＞0.05),HbA1c水平有統計學差異 (P ＜0.05)(表 1)。

表1 T2DM組和 Con組基本臨床資料比較(±s)

表1 T2DM組和 Con組基本臨床資料比較(±s)

與 con組比較 ,△ P＜0.05.

組別 n 年齡 男/女 FPG 2hPG HbA1C T C LDL DM病程 吸煙T2DM 20 60± 7 8/12 7.72± 0.72△ 11.5± 1.7△ 7.8± 0.68△ 4.45± 0.45 2.69± 0.29 10.4± 3.2 3 Con 20 59±8 9/11 4.85±0.36 6.65±0.65 4.77±0.40 4.41±0.38 2.56±0.52 — 4

4.2 EPCs的形態學觀察 T2DM組和 Con組外周血單個核細胞接種于鼠尾膠原包被的培養瓶中,細胞大多呈懸浮生長,第 2天可見少數細胞貼壁 ,第 4天左右可以形成從中間向外放射的細胞集落,其上常附著少量圓形細胞;以后梭形細胞逐漸增多,7d時長成典型的長梭形、雙極針狀(A),并出現有的細胞首尾相連成條索狀(B)。培養第 2周時,梭形細胞開始消失,取而代之出現的是橢圓形細胞,呈鵝卵石樣(C),有的細胞可形成管腔狀結構(D)。種植 1.0×106個外周血單個核細胞約可獲得(5.5～ 6)× 104個貼壁細胞。

圖1 內皮祖細胞培養的形態學觀察

4.3 EPCs的鑒定

單個核細胞培養 7d后通過激光共聚焦顯微鏡鑒定,細胞攝取 Dil-acLDL(紅色,激發波長 543nm)和結合 FITC-U EA-1(綠色,激發波長 477nm),Dil-acLDL和 FITC-UEA-1雙染色陽性細胞(呈黃色)被認為是正在分化的 EPCs,見圖 2。流式細胞儀檢測貼壁細胞表面標志,結果顯示:貼壁細胞中,表達CD34占 (32.15± 8.68)%,表達 CD133占 (18.73± 7.12)%,表達 KDR占 (69.45± 8.21)%,見圖 3。

圖2 激光共聚焦顯微鏡鑒定培養 7d的 EPCs

圖3 EPCs表面抗原標志檢測

4.4 M T T檢測黃芪多糖對 T2DM外周血 EPCs增殖的影響 T2DM患者 EPCs的增殖能力較健康對照組明顯下降(P＜0.05)。黃芪多糖(APS)顯著增加 T2DM患者 EPCs的增殖能力,呈一定的量效與時效關系,在 200mg/L濃度時開始較T2DM對照組明顯增強(P＜0.01),于 800mg/l時達最大效應(P＜0.01),故在觀察 PI3K阻斷劑影響的試驗中選擇 800mg/L的黃芪多糖培養內皮祖細胞 24 h。200mg/LAPS作用 6h后,EPCs增殖能力開始明顯增強,24h達到高峰,48h時略有下降,但仍明顯高于對照組。 (表 1)。

表1 黃芪多糖對 T2DM患者 EPCs增殖作用的影響(±s)

表1 黃芪多糖對 T2DM患者 EPCs增殖作用的影響(±s)

注:與 T2DM組比較 ,△P＜0.01;與健康對照組比較,▲P＜0.05。

A490nm值組別6h 12h 24h 48h Con組 0.332± 0.003 0.380± 0.004 0.479± 0.004 0.461± 0.003 T2DM對照組 0.306±0.015▲ 0.353±0.011▲ 0.455± 0.018▲ 0.433±0.001▲APS 50mg/L組 0.315± 0.010 0.362± 0.012 0.476± 0.006 0.437± 0.014 APS 200mg/L組 0.322± 0.008△ 0.374± 0.008△ 0.487± 0.018△ 0.469± 0.002△APS 800mg/L組 0.324± 0.001△ 0.396± 0.010△ 0.500± 0.010△ 0.488± 0.011△APS3200mg/L組 0.305± 0.007 0.346± 0.013 0.443± 0.009 0.429± 0.010 APS6400mg/L組 0.292± 0.016△ 0.335± 0.010△ 0.420± 0.015△ 0.395± 0.006△

5 討 論 EPCs是一類能分化為血管內皮細胞的前體細胞,存在于骨髓、脂肪組織、臍帶血和外周血中。EPCs不僅參與人胚胎血管生成,同時也參與出生后血管新生和內皮損傷后的修復過程。糖尿病患者外周血 EPCs數量減少,其增殖、遷移和成血管能力降低,設法增加 EPC的數量并改善其功能可促進損傷血管的修復和新生,為防治糖尿病血管并發癥提供了新的治療策略。

成人外周血 EPCs含量極少,從人外周血單個核細胞中分離出來的 EPCs僅占 0.05%～ 0.1%,如何將 EPCs進行體外擴增是關鍵。內皮祖細胞的培養有別于其它成體干細胞,其培養基要求 EGM-2MV專用培養基,但是專用培養基價格昂貴,很多學者根據 EGM-2MV的主要成分使用 M199培養基添加VEGF、bFGF、EGF和 IGF-1等細胞因子同時配合胎牛血清,來代替專用培養基,用于內皮祖細胞的培養。在培養內皮祖細胞之前,培養板往往要包被纖維連接蛋白或者明膠幫助細胞貼壁,有利于細胞快速貼壁生長。本研究只用了 V EGF、bFGF兩種細胞因子,結果發現 EPCs的分化和生長狀態良好。初始貼壁生長的 EPCs逐漸形成長梭形,但增殖緩慢;在第 2周左右,開始出現鋪路石樣細胞,增殖較快。這與 Gulati等[12]的實驗結果相一致。纖維連接蛋白是基質中一種糖蛋白,主要起促進細胞貼壁的作用,但價格昂貴。鼠尾膠原的主要成分為 I型膠原,具有成本低廉、取材方便和黏附力強等優點,可用于培養微血管內皮細胞、人臍靜脈內皮細胞、腦星形膠質細胞、皮膚角朊細胞和前庭毛細胞等。宋曉紅等[13]以鼠尾膠原為黏貼劑建立了人鼻腔纖毛上皮細胞培養模式。由于許多細胞在 I型膠原中培養可獲得與機體相似的組織形態,如頜下腺上皮細胞、乳腺上皮細胞可分別增殖分化形成腺管樣結構,因此鼠尾膠也常被用于管狀結構新生模型的研究。李明煥等[14]發現在鼠尾膠中,人臍靜脈內皮細胞在生長因子的刺激下,可以形成樹枝狀毛細血管樣結構;章必成等[15]以鼠尾膠原為貼黏劑成功培養了小鼠淋巴管內皮細胞,并具有形成淋巴管樣結構的能力。本研究使用了自行制備的鼠尾膠原,沒有使用昂貴的纖維連接蛋白。結果發現也能獲取較多的 EPCs,但其成本卻大大減低。

研究表明 GM-CSF、 G-CSF、V EGF、他汀類、雌激素、ACEI、EPO等動員骨髓釋放 EPCs并使其功能正?；?。APS是黃芪的主要活性物質,能使人外周血單核細胞(PBM C)產生 GCSF和 GM-CSF等造血細胞因子,并呈量效時效關系[16];能有效地促進小鼠和人骨髓與外周血造血干 /祖細胞的增殖。 EPCs和造血干細胞來源于共同的祖細胞,均由成血管細胞分化而來?；?EPCs和造血干細胞的密切關系,推測 APS可能影響EPCs的數量及功能。本研究證實了 APS在一定范圍內呈劑量和時間依賴性地促進 EPCs增殖?？梢?APS不僅具有保護胰島β細胞,調節血糖 ,改善脂代謝和胰島素抵抗的作用[5～11];可能還通過促進 EPCs的增殖、分化,促進內皮修復,在治療糖尿病血管并發癥中發揮重要作用。

綜上所述,本研究建立了一種培養擴增人外周血中 EPCs的簡便且低成本的方法,為 EPCs的進一步深入研究和應用打下了基礎。黃芪多糖可能通過促進 T2DM患者外周血 EPCs的增殖、分化 ,達到治療糖尿病血管并發癥的目的,但具體機制還有待進一步深入的研究來闡明。

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