水牛卵母細胞冷凍保存初步研究

邵慶勇，楊紅遠，牛自兵，李衛娟，朱 蘭，呂春榮，洪瓊花

（1.云南省畜牧獸醫科學院，昆明 650224；2.云南省芒市畜牧獸醫局）

卵母細胞的有效冷凍保存不僅可以儲備哺乳動物遺傳資源，而且在家畜胚胎移植產業化技術體系中起著重要作用，動物卵母細胞是母系遺傳信息的載體，卵母細胞的長期冷凍保存，在品種資源保護和改良、資源共享與交換、瀕危動物的挽救、核移植、轉基因動物研制等方面都具有獨特的優勢和應用價值。卵母細胞的冷凍保存，對探討其低溫生物學特性和體外受精機理的研究有重要意義。牛卵母細胞的冷凍保存，國外開展了不少研究，并獲得了可喜的進展，Vajta等于1998年獲得了來自冷凍牛體外成熟卵母細胞的牛犢［1］，到2002年，Vieira等又獲得了來自冷凍未成熟牛卵母細胞的牛犢［2］。但水牛方面的研究較少，國內開展水牛卵母細胞冷凍保存的報道也較少，僅見西南大學和廣西大學研究人員開展了部分研究，整體上還停留在初步探索的階段［3-9］。本試驗在借鑒牛羊胚胎冷凍的基礎上開展水牛MⅡ期卵母細胞的玻璃化冷凍保存和水牛G V期卵母細胞常規冷凍保存，以比較不同冷凍保護劑組成及冷凍載體對MⅡ期卵母細胞玻璃化冷凍保存解凍后的發育影響，同時探索不同預處理時間和平衡時間對水牛G V期卵母細胞常規冷凍保存的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗用各種液體的配制

1）抽卵液：TCM-199（GIBCO）。

2）體外成熟液：TCM-199+15 μg/mL FSH（ICP）+15 μg/mL LH（Bioniche）+1 μg/mL E2（Sigma）+100 μmol/L半胱胺（Sigma）+10%FBS（Hyclone）。

3）mSOF 液：NaCl 0.629 4 g，KCl 0.053 4 g，KH2PO40.016 2 g，NaHCO30.210 6 g，乳酸鈉 0.037 0 g，丙酮酸鈉0.003 6 g，青霉素 0.006 5 g，鏈霉素 0.005 0 g，CaCl2·2H2O 0.0072g，MgCl2·6H2O0.0348g，超純水溶解定容到100mL，調 pH 至 7.2～7.4，0.2 μm 濾膜過濾器過濾滅菌，4℃保存。

4） 培養液（mSOFaa液）：mSOF+1%NEAA+2%EAA+0.3%BSA。

5）玻璃化冷凍預處理液、玻璃化溶液和解凍液的配制：30%（w/v）聚蔗糖添加0.5 mol/L蔗糖，經mPBS溶解后制成FS溶液。

預處理液和冷凍液的配制見表1。

表1 各種預處理液和冷凍液組成（v/v）%

1.2 OPS管和GMP管的制備 自制的小酒精燈上，明火將0.25mL（France）塑料細管加熱，待變軟后拉制成OPS（open pulled straw）管。在空氣中冷卻后用手術刀片在其細端切開。OPS管的管壁外徑為0.20 mm±0.01 mm，管壁厚約0.02 mm，細端長度為2.5cm±0.5cm。將直徑為2.58 mm、長度為10cm的玻璃細管（北京正天易科貿有限責任公司生產）于中部在酒精燈火焰上加熱、拉細，然后用小砂輪片輕劃，斷開，制成2根GMP（glass micropipette）管。在體視顯微鏡下檢查端口大小是否平齊，內徑較卵母細胞直徑稍大一點，并用酒精燈火焰對有刺部位進行短時燒熔。

1.3 卵母細胞的采集與成熟培養 將從屠宰場采集的水牛卵巢放入含青、鏈霉素各5萬u/L的30～35℃生理鹽水保溫瓶中，4 h內運回實驗室。在實驗室內用含雙抗的38℃生理鹽水沖洗2遍后，先在帶有18G針頭的10mL一次性注射器內抽取5mL 38℃抽卵液，然后抽吸卵巢表面2～6 mm直徑的卵泡，每抽完4～6個卵巢后，把液體注入15mL離心管于38℃靜置沉淀。最后把離心管下1/2液體置于直徑為90 mm的一次性培養皿中，在保溫板溫度為38℃的體視鏡下撿卵，定級。

從卵巢上直徑大于2 mm的卵泡中獲得卵母細胞，外面有多層卵丘細胞包圍，稱卵丘-卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complexes，COCs），根據形態特征將 COCs分為4個級別，A級為卵胞質致密均勻，至少有4層以上卵丘細胞完全包裹卵母細胞，呈黑色至深灰色，實體顯微鏡下光線不能透過；B級為卵胞質致密，有2～4層卵丘細胞完全包裹卵母細胞，胞質深灰色，實體顯微鏡下觀察光線微能透過；C級為半裸卵，卵母細胞周圍2/3被一層卵丘細胞包裹；D級為裸卵，無卵丘細胞包被。A、B級卵母細胞用于開展本試驗。

將準備培養的COCs在抽卵液中洗滌3次后，用成熟液洗滌3次。然后置于預平衡2 h以上、上覆礦物油的100 μL 成熟培養滴中，10～15 枚 COCs/滴；于 38.5 ℃、5%CO2的空氣、100%濕度的培養箱中培養24 h。

1.4 卵母細胞冷凍和解凍

1.4.1 卵母細胞的毒性試驗 體外成熟24 h的卵母細胞采用移液槍吹打法脫去擴散卵丘細胞，在體視顯微鏡下觀察極體，把排出極體的正常卵子先分別置于10%EG、10%EG+10%DMSO的預處理液中平衡30 s，再分別置于冷凍保護劑 EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40 中處理25 s后，先于0.25 mol/L蔗糖液中脫洗1 min，再移入0.15 mol/L的蔗糖解凍液中平衡5 min以脫去保護劑，用成熟液洗滌3次后移入培養液中培養30 min后進行孤雌激活以觀察成熟卵母細胞的發育率。對照組為直接進行孤雌激活，未經過毒性試驗。

1.4.2 MⅡ期卵母細胞的OPS或GMP法冷凍解凍 將室溫調至25℃，使試驗用具及試劑得到充分平衡，試驗在37～38℃恒溫臺上操作。首先將體外成熟24 h的卵母細胞采用移液槍吹打法脫去擴散卵丘細胞，在體視顯微鏡下觀察極體，用口吸管連接的OPS/GMP管把排出極體的正常卵子移入10%EG、10%EG+10%DMSO中平衡30s，然后移入玻璃化液（EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40）中平衡25 s，最后將卵子吸入OPS/GMP管中直接投入液氮冷凍保存。每支管裝入8～10枚卵母細胞。

解凍時，OPS/GMP管從液氮中取出后，立即將含有卵母細胞部分直接浸入置于恒溫臺上的含有0.25 mol/L蔗糖解凍液的培養皿中，溶解后將卵母細胞從OPS/GMP管中吹出并搖動混勻，在此液中平衡1 min，然后移入0.15 mol/L蔗糖解凍液中平衡5 min，再用成熟培養液洗滌3次后移入培養液中培養30 min后進行孤雌激活。

1.4.3 G V期卵細胞的常規冷凍保存及解凍 在借鑒牛羊胚胎常規冷凍保存方法基礎上，采用程序降溫儀冷凍保存水牛G V期卵母細胞，G V期卵母細胞先分別在0.5 mol/L和1.0 mol/L EG中平衡5 min或8 min后，將卵母細胞移入事先裝有1.5 mol/L EG的0.25mL塑料細管中平衡15 min或18 min，然后將細管裝入冷凍儀，以-3℃/min的速率降溫至-6.5℃植冰，植冰后保持10 min，再以-0.3℃/min的速率降至-35℃，保持10 min后投入液氮中保存。卵母細胞解凍是在25℃室溫下，將細管從液氮中取出，在空氣浴和30℃水浴中分別晃動10 s，取出細管，剪掉兩端，用內含0.5 mol/L蔗糖液的注射器將內容物沖洗到培養皿中，在顯微鏡下回收卵母細胞，然后將卵母細胞移入新鮮的0.5 mol/L、0.3 mol/L蔗糖液中分別平衡5.0 min，最后用成熟液洗卵，移入新鮮成熟液中進行體外成熟培養。

1.5 卵母細胞的激活 毒性試驗和冷凍解凍后的MⅡ期卵母細胞用含 5 μmol/L Ionomycin（Sigma）的培養液激活處理5 min，經培養液洗滌3次后再置于含2 mmol/L 6-DMAP（Sigma）的培養液中培養4 h，最后移入mSOFaa液中進行體外培養。

1.6 卵母細胞存活率和發育能力的鑒定 卵母細胞凍后形態恢復率的鑒定主要依據其凍后細胞膜和透明帶的完整性及胞質和卵丘細胞是否均勻加以判斷，以成熟率和孤雌激活后卵裂率作為評定卵母細胞發育能力的指標。

1.7 統計分析 采用SPSS中的ANOVA分析，數據在分析前進行反正弦轉化，各處理平均值的比較采用鄧肯檢驗。

2 結果

表2 水牛MⅡ期卵母細胞毒性試驗結果

2.1 不同玻璃化冷凍保護劑組成對MⅡ期水牛卵母細胞毒性試驗 分別用EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40玻璃化冷凍液對MⅡ期水牛卵母細胞進行毒性試驗。試驗組卵母細胞形態正常率與對照組均無顯著性差異（P＞0.05），4種冷凍液處理組間形態正常率亦無顯著性差異（P＞0.05）；EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40 處理組卵母細胞孤雌激活卵裂率分別為（68.44±3.14）%、（64.53±4.88）%、（50.54±4.18）%、（46.06±3.43）%，EFS30、EFS40 組與對照組（75.28±4.70）%無顯著性差異（P＞0.05），EDFS30、EDFS40組與對照組和EFS30、EFS40組間差異顯著（P＜0.05）（詳見表2），說明含DMSO冷凍液毒性較大。

2.2 水牛MⅡ期卵母細胞OPS法冷凍保存研究 分別以 EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40 作為冷凍液，采用OPS法冷凍保存MⅡ期水牛卵母細胞。結果表明：EDFS30、EDFS40組卵母細胞解凍后形態正常率顯著高于 EFS30、EFS40 組 （P＜0.05），EDFS30 與 EDFS40 間、EFS30與EFS40間形態正常率均無顯著性差異（P＞0.05）；EDFS40、EDFS30、EFS40 組卵母細胞解凍后孤雌激活卵裂率分別為（31.60±4.13）%、（28.49±3.69）%、（23.08±3.36）%，均顯著高于 EFS30組的（19.05±3.93）%（P＜0.05）。其中以EDFS40作為冷凍液，卵母細胞冷凍解凍后孤雌激活卵裂率最高（詳見表3）。

表3 不同冷凍液OPS法冷凍保存水牛MⅡ期卵母細胞效果比較

2.3 不同載體玻璃化冷凍MⅡ期水牛卵母細胞效果 以EDFS 40作為冷凍液，采用GMP法冷凍MⅡ期水牛卵母細胞，解凍后形態正常率和卵裂率分別為（94.55±1.93）%、（45.63±2.56）%。與 OPS 法相比，解凍后卵母細胞形態正常率無顯著差異，但GMP法卵裂率較OPS法高 14.03個百分點（P＜0.05，詳見表 4）。

表4 OPS、GMP法冷凍保存水牛MⅡ期卵母細胞效果比較

2.4 水牛G V期卵母細胞常規冷凍保存研究 試驗設計了不同預處理時間和平衡時間的細管常規冷凍，結果顯示各冷凍組的形態正常率和極體排出率與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），預處理 5 min、8 min 和平衡15 min、18 min各組間解凍后卵母細胞形態正常率和極體排出率均無顯著性差異（P＞0.05），但以預處理5 min、平衡15 min組的形態正常率和極體排出率相對較高，分別為 72.73%、27.27%（詳見表5）。

表5 不同預處理時間和平衡時間常規冷凍水牛G V期卵母細胞結果比較

3 討論

3.1 本研究首先開展不同冷凍液組成對MⅡ期水牛卵母細胞毒性試驗，結果表明含DMSO冷凍液毒性較大。但分別以 EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40 作為冷凍液、采用OPS法冷凍保存MⅡ期水牛卵母細胞，結果表明以EDFS40作為冷凍液，卵母細胞冷凍解凍后孤雌激活卵裂率最高，達（31.60±4.13）%。玻璃化冷凍液中所采用的滲透性抗凍保護劑主要有丙三醇（glycerol）、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇（PROH）、乙二醇（EG）和乙酰胺（acetamide）、丁二醇（butadiene）等，這些化學物質對卵母細胞具有化學毒性，冷凍液滲透到細胞內，一方面可通過抑止細胞內冰晶的形成來保護細胞免受機械損傷，另一方面細胞長時間暴露于高濃度抗凍保護劑時容易受到化學損傷。EG分子量較小，對細胞膜的通透性較強，化學毒性較小，玻璃化狀態形成稍差，常用于慢速程序冷凍中；DMSO分子量較大，通透性較EG差，化學毒性較大，對細胞骨架的損傷特別明顯，但玻璃化狀態形成好，DMSO對卵細胞的毒性決定于暴露過程中的持續時間和溫度，表現為較低溫度下應用DMSO具有較好結果［10］。結合2種抗凍劑的冷凍液既提高了抗凍劑的滲透性，又可緩解DMSO的化學毒性，形成良好的玻璃化狀態，因此采用EG加DMSO作為冷凍保護劑主要成分的EDFS 40效果較好?？箖霰Ｗo劑對胚胎毒性從小到大順序為：EG＜甲醇＜DMSO＜甘油＜丙二醇＜丁二醇［11］?？梢?，選擇適當的冷凍保護劑至關重要，目前尋找容易實現玻璃化并具有低或無細胞毒性的冷凍保護劑是進一步提高玻璃化冷凍效率的關鍵。

3.2 本試驗以EDFS40作為冷凍液，采用GMP法冷凍MⅡ期水牛卵母細胞，解凍后形態正常率無顯著差異，但GMP法卵裂率高于OPS法，這可能跟玻璃細管和塑料OPS細管的導熱性能有關。細管的冷凍降溫速度最高只能達到2 000℃/min，開放式拉長細管（OPS）由0.25mL細管加熱變軟后拉制而成，因管壁較細管薄，冷凍和解凍速度高達20 000℃/min，是細管法的10倍［12］，GMP管由玻璃細管拉制而成，管壁更薄，導熱性更強，降溫和解凍速率比OPS更高，投入液氮后不象OPS管那樣容易炸裂，玻璃比塑料密度大，在液氮中不像OPS管那樣浮起，玻璃細管可自行拉制，內徑范圍遠比OPS管寬，由于GMP玻璃化冷凍卵母細胞和胚胎的原理和操作與OPS法相似，加之上述優點，GMP法顯得更便利，有望在卵母細胞和胚胎冷凍中得到廣泛應用［3］。

3.3 本試驗參照胚胎常規冷凍保存設計了不同預處理時間和平衡時間G V期卵母細胞的細管法常規冷凍，結果顯示各冷凍組的形態正常率和極體排出率與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），預處理5 min，平衡 15 min組的形態正常率和極體排出率相對較高，分別為72.73%、27.27%。據報道，由于卵母細胞和早期胚胎的發育階段不同，在超微結構上存在很大的差異，因此用胚胎的冷凍方法可能不完全適合于卵母細胞的冷凍保存。相對于慢速冷凍保存來講，玻璃化快速冷凍保存應用了更高濃度的保護劑（最高可達7M）并大大增加了冷凍保存的速度，在此情況下，細胞迅速脫水，在不產生冰晶的情況下，冷凍液的粘度增大從而引起冷凍液呈玻璃狀。因此，玻璃化冷凍方法產生后，研究者更傾向于利用該方法研究卵母細胞的冷凍［12］，我們將在以后的工作中進一步開展水牛G V期卵母細胞常規冷凍和玻璃化冷凍比較。

3.4 發育階段不同，對冷凍和卵母細胞的使用存在影響。Fuku等［13］研究表明牛G V期卵母細胞要比成熟的卵母細胞更敏感于抗凍保護劑，國內也有學者認為成熟卵母細胞玻璃化冷凍效果顯著優于G V期［14］。Im等［15］研究了成熟階段對冷凍效果的影響，在體外成熟培養0、6、12、18、24 h的牛卵母細胞常規程序冷凍，解凍后再進行培養達到24 h，結果表明，未成熟卵母細胞比成熟卵母細胞對冷凍的耐受性低。M II期卵母細胞優越性在于卵母細胞已處于成熟期，解凍后可直接用于體外受精，無需再進行體外成熟培養，其不足在于具有對溫度敏感性非常高的紡錘體，在降溫過程中極易解聚，使出現非整倍染色體的幾率增加，影響卵母細胞的發育。冷凍保存G V期卵母細胞因為染色體有核膜包裹則可避免損傷，但主要問題不是核而是胞質的改變，G V期卵母細胞冷凍后超微結構（微絨毛、線粒體、內質網等）損傷嚴重，解凍后又受到成熟效果的影響而大大降低利用率。另外，G V期卵母細胞解凍常見的結果是卵丘細胞脫落，破壞了未成熟卵母細胞卵丘細胞及顆粒細胞之間代謝底物的攝取途徑（胞間連接），而成熟卵母細胞和周圍的卵丘細胞不再耦聯，卵丘細胞的突起自卵母細胞表面收回，這可能也是成熟卵母細胞較GV期卵母細胞耐凍的原因之一。

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