影響遼寧絨山羊母羔胚胎體外生產因素的研究

豆興堂 ，宋先忱，郭 丹 ，張興會

（1.遼寧省遼寧絨山羊原種場有限公司,遼陽 111000；2.遼寧省畜牧科學研究院，遼陽 111000）

自然情況下，成年母羊不經激素處理，活體采卵僅能獲得3.6～6.6枚可用卵母細胞［1］，經生殖激素處理每次能獲得10～20枚［2］，而每只幼齡羔羊在生殖激素誘導卵泡發育下平均每次可獲得80～120枚可用卵母細胞［3］。因此，如果將幼羔超排技術與羊體外受精技術、胚胎移植技術進行組裝集成（juvenile in vitro embryo transfer，JIVET），運用于養羊生產，可將羊的繁殖效率較常規胚胎移植提高約20倍，較自然繁殖提高約60倍，并使世代間隔縮短到正常的1/3～1/4，這將充分挖掘和利用優良母羊的早期繁殖潛力，大大加快羊育種及品種改良進程，同時也將解決羊胚胎移植商業化所需胚胎來源匱乏及胚胎生產成本昂貴的問題，將大大促進胚胎生產的商業化應用，應用前景十分廣闊。本試驗利用4～8周齡遼寧絨山羊母羔，進行超排、卵母細胞成熟培養、體外受精等研究，期望建立絨山羊體外胚胎生產技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料 4～8周齡遼寧絨山羊母羔羊。隔離飼養于遼寧省畜牧科學院內，母羔與大母羊同群舍飼，主要飼喂苜蓿草、羊草，補飼羔羊顆粒料、鹽磚等，自由飲水。

1.2 主要儀器設備 CO2培養箱：HERA Cell 150，美國；立體顯微鏡：Minitube，德國；倒置顯微鏡：LEICA DMI 3 000 B，德國；電子天平：十萬分之一克，北京賽多利斯天平公司。

1.3 主要試劑 FSH：批號R9D19A；LH：批號R8K03VB；均為加拿大產。PMSG：寧波激素廠；Heparin：Bioszune；EGS：采集發情遼寧絨山羊母羊血液，56℃滅活30 min，0.22 μm 濾過；TCM199、E2、N-EAA、EAA，Sigma；超純水：Milli-Q純水儀制；其余試劑均為Sigma產。

1.4 母羔超排采集卵母細胞 最后一次超排注射12～14 h后采集卵母細胞，常規手術法暴露卵巢，用10mL注射器逐一刺破卵泡抽取卵泡液及卵母細胞。應注意抽吸力量要輕。采卵液為：TCM-HCO3+10 ug/mL Heparin+5%EGS+2.2 mg/mL Na-pyrunate+0.146 mg/mL L-Glutamine+2.383 mg/mL HEPES+2.603 mg/mL HEPES-Na+10 μL/mL青鏈霉素。

1.5 卵母細胞成熟培養 采集的卵母細胞液在37℃40倍立體顯微鏡下，用撿卵針撿取卵母細胞。在采卵液、成熟培養液中各洗3遍，挑選A（卵丘細胞3層以上，胞質均勻）、B（1～2層卵丘細胞，胞質均勻）級卵母細胞進行成熟培養。用四孔板培養，每孔600 μL成熟液，上覆礦物油，38.5℃、5%CO2預先平衡2 h以上。將洗過的卵母細胞轉入四孔板，每孔30～35枚卵母細胞在38.5℃、5%CO2下進行體外成熟培養24～26 h。

1.6 體外受精 精子獲能處理：將自制細管凍精，放入38～40℃水浴解凍，檢查活力。取100～200 μL精液輕輕加入到裝有600～800 μL獲能液（添加20 μg/mL肝素的SOF液，培養箱中平衡2 h以上）試管底部，將試管放入CO2培養箱，精子上游獲能處理20～30 min。

卵母細胞處理：將成熟培養的卵母細胞從成熟培養液中移出，轉入1%透明質酸酶的受精液中作用1～2 min，輕輕吹打，去掉顆粒細胞；在受精液中洗滌3次，再將卵母細胞轉入含有受精液的四孔板（每孔400 μL受精液，上覆礦物油，培養箱中平衡2 h以上）中，每孔25～30枚卵母細胞，準備受精。

精卵體外受精：輕輕吸取上游獲能處理試管內液體的上清液，在立體顯微鏡下，輕輕加入到含有卵母細胞的四孔板中，每孔100～150 μL上清液，加入時注意避免形成氣泡。做好記錄，將四孔板放入CO2培養箱，精卵受精作用 22～24 h。

1.7 早期胚胎體外發育培養 精卵受精作用后，輕輕吹打卵母細胞去掉粘附的精子，將假定合子在SOF-HCO3+BSA等發育液中洗滌3～5次，移入600 μL發育液四孔板培養孔中，每孔 25～30 枚，38.5 ℃、5%CO2、5%O2、飽和濕度下培養24 h。顯微鏡下觀察卵裂情況，移出棄掉單細胞卵，統計卵裂率，做好記錄。其余胚胎繼續培養24 h，換SOF-HCO3+10%EGS等發育液繼續培養，每48 h更換1/2新鮮培養液。4～5 d后觀察囊胚發育情況，統計囊胚率。

1.8 實驗設計

1.8.1 不同超排方法對超排效果、胚胎發育的影響 將12只母羔隨機分成2組。Ⅰ組用PMSG+FSH超排處理，即先肌肉注射PMSG 400 u，以后間隔12 h分別肌肉注射FSH 40 mg 3次；Ⅱ組用FSH+PMSG超排處理，即先間隔12h分別肌肉注射FSH3次，最后再肌肉注射PMSG400u。用SOF-HCO3培養系做受精、發育培養。

1.8.2 成熟液添加EGF對卵母細胞成熟、胚胎發育的影響 用PMSG+FSH法超排母羔，2種成熟液進行成熟培養，將成熟后的卵母細胞用0.5%的透明質酸酶脫去卵丘細胞，在體視顯微鏡下用吸胚管反復撥動卵母細胞，觀察是否排出第一極體，統計極體率。

TCM-HCO3+10 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+1 μg/mL E2+10%EGS+2.2 mg/mL Na-pyrunate+0.146 mg/mL LGlutamine+0.012 mg/mL cysteine+10 μL/mL 青鏈霉素，為對照組。EGF組：對照組+20 ng/mL EGF。用SOF-HCO3培養系做受精、發育培養。

1.8.3 兩種受精體系卵裂率、囊胚率比較 用PMSG+FSH法超排母羔，用添加EGF的成熟液成熟培養，分別用TALP液、SOF-HCO3液體外受精，Ⅰ組：用SOF-HCO3+20 μg/mL Heparin等做精子獲能處理液，SOF-HCO3+BSA等做受精、發育培養。Ⅱ組：用sperm-mTyrode液做精子洗滌液，fert-mTyrode+20 μg/mL Heparin等液做精子獲能、受精，SOF-HCO3+BSA等做發育培養。比較2組卵裂率、囊胚率。

1.9 統計分析 試驗數據分析處理：采用SPSS 13.0軟件“Independent-Samples T Test”對數據進行統計學比較分析。

2 結果與分析

2.1 超排方法對卵母細胞數、卵裂率、囊胚率的影響 由表1可知，2種超排方法獲得的卵母細胞數無顯著差異（P＞0.05），但卵裂率和囊胚率均有極顯著差異（P＜0.01）。

表1 不同超排方法對超排效果、胚胎發育的影響

2.2 添加EGF對卵母細胞成熟、胚胎發育的影響 由表2可見，添加EGF組成熟率顯著高于對照組（P＜0.05），卵裂率差異不顯著（P＞0.05），但囊胚率差異顯著（P＜0.05）。見圖1～4。

表2 添加EGF對卵母細胞成熟、胚胎發育的影響

圖1 母羔超排卵巢

圖2 卵母細胞（第一極體）400×

圖3 2～4細胞胚胎200×

圖4 囊胚100×

2.3 兩種受精體系對胚胎發育的影響 由表3可見，SOF受精體系卵裂率顯著高于TALP（P＜0.05），囊胚率極顯著高于 TALP（P＜0.01）。

表3 受精體系對胚胎發育的影響

3 討論

幼羔超排效果除了易受羔羊年齡、個體差異等影響外，超排方法對超排效果影響也較大。劉東軍［4］等對2～4月齡羔山羊用FSH、FSH+LH（靜脈注射）和FSH+LH（肌肉注射）3種方法進行超排處理，分別平均回收16.0、20.3和15.0枚卵母細胞。成熟卵母細胞經體外受精、體外發育培養后其2～4細胞胚胎的發生率分別為5.6%、6.7%和31.7%。張鎖鏈［5］等以FSH或FSH-LH 4種不同處理方法對29只68～110日齡羔山羊進行超排處理，結果共采集卵泡卵母細胞708枚，平均每只羔羊采卵24.4枚。分別用經鈣離子載體A-23178或肝素進行獲能處理的精子對體外培養成熟的卵子進行體外受精，結果精子穿入卵率分別為54.8%和34.4%，發育至2～4細胞胚的卵裂率分別為28.6%和41.9%。PMSG是糖蛋白激素中唯一獨特的促性腺激素，同一分子中具有黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，FSH）2種促性腺激素的活性，由于PMSG在動物體內的半衰期較長，同一分子又具有FSH和LH的雙重活性，在動物體內，其生理作用是對卵巢和睪丸的靶細胞受體，特異性極強。母羔超排中，大多數都是在最后注射PMSG。本實驗結果顯示，先注射PMSG組卵母細胞卵裂率、囊胚率極顯著高于后注射PMSG組，可能與后注射PMSG作用時間短、卵母細胞成熟度不夠，尤其胞質蛋白合成儲存不足有關，還需進一步試驗探討。

EGF（epidermal growth factor），上皮生長因子，表皮細胞生長因子是人體內的一種活性物質，是由53個氨基組成的活細胞，由刺激表皮細胞生長因子受體之酪氨酸磷酸化，達到修補增生肌膚表層細胞，其最大特點是能夠促進細胞的增殖分化，從而以新生的細胞代替衰老和死亡的細胞。王艾平［6］等在卵母細胞成熟液中添加EGF，結果含50 ng/mL EGF（表皮生長因子）組COCs成熟率（75.45%～75.80%）和卵裂率（72.4%～74.1%）均顯著高于其它組。表明EGF對COCs體外成熟和卵裂發育具有明顯的促進作用。劉丑生［7］等在綿羊卵母細胞成熟液中添加EGF，結果為50 ng/mL的EGF的成熟率和卵裂率分別為71.2%和45.5%，顯著高于對照組和10、20、30、40 ng/mL組（P＜0.05）。國外較多采用TALP液研究性成熟前山羊卵母細胞的體外受精，用添加了50 μg/mL肝素的mDM液獲能，用添加1 μg/mL亞?；撬岬腡ALP液受精［8］。張鎖鏈等采集種公羊新鮮精液，以0.5 μMA 23187處理1 min或在培養液中添加50 μg/mL肝素獲能，用2 mM咖啡因、20 μg/mL BSA的 BO液作受精液，2～4細胞胚的卵裂率分別為28.6%和41.9%。趙宏遠［9］采集超排母山羊羔卵母細胞，成熟培養后用SOF液受精，受精培養23～26 h組，平均卵裂率為48.33%。PMSG+FSH超排、卵母細胞成熟液添加20 ng/mL EGF、SOF基礎液作受精液、胚胎發育液較適合絨山羊母羔體外胚胎生產，如何進一步提高效率還需進一步探索。

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