臧玲玲,李永吉,孫 凌,郭玉巖,管慶霞,楊志欣,侯 佳
(黑龍江中醫藥大學藥學院,哈爾濱 150040)
青風藤為防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤莖,臨床常用于治療風濕、類風濕性關節炎及心率失常等[1-2].藥效物質基礎為青藤堿,青藤堿的有效提取,直接影響青風藤的藥效發揮,因此,本文通過對不同的提取純化方法的比較,優選出青風藤的最佳精制工藝,為工藝放大生產提供參考,現將研究結果報道如下.
青風藤藥材(購自哈爾濱藥材市場).青藤堿對照品(中國藥品生物制品檢定所提供,批號0775—200105).甲醇(色譜純,DIKMA TECHNOLOG INC),實驗所用其他試劑均為分析純.
Waters高效液相色譜儀,含有在線脫氣、高壓四元梯度泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(DAD)、Empower色譜工作站(美國);分析天平(Sartorius CP225D);酸度計(梅特勒-托利多DELTA 320).
取400 g青風藤藥材,用8倍量的70%乙醇,連續回流提取2次,每次1 h,合并提取液,濾過,濾液濃縮至250mL,用微孔濾膜濾過,取續濾液,即得.
1)方法 1[3]:精密量取 30mL 藥液蒸干,用2%鹽酸25mL溶解,濾過,濾液加氨試液調pH值至10,用氯仿萃取2次,每次20mL,合并氯仿層,氯仿液蒸干,得青藤堿精提物.2)方法2:精密量取30mL藥液蒸干,用2%鹽酸25mL溶解,濾過,濾液加氨試液調pH值至10,用氯仿萃取2次,每次20mL,合并氯仿層;取氯仿萃取液,加2%鹽酸水溶液萃取2次,每次40mL,收集鹽酸水溶液層,加氨試液調pH值至10后,再加氯仿萃取2次,每次80mL,收集氯仿液,蒸干,得青藤堿精提物.3)方法3:精密量取30mL藥液蒸干,用2%鹽酸25mL溶解,濾過,濾液加氨試液調pH值至10,用氯仿萃取2次,每次20mL,合并氯仿層;取氯仿萃取液,加2%鹽酸水溶液萃取2次,每次40mL,收集鹽酸水溶液層,加氨試液調pH值至10后,再加氯仿萃取2次,每次80mL,收集氯仿液,再加2%鹽酸水溶液萃取2次,每次160mL,收集鹽酸水溶液層,加氨試液調pH值至10后,再加氯仿萃取2次,每次320mL,收集氯仿液,蒸干,得青藤堿精提物.
DIKMA Diamonsil ODS C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm);流動相為磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液加1‰三乙胺,用磷酸調pH值至3.0)∶甲醇(80∶20);流速為 1.0mL/min;檢測波長265 nm;柱溫25℃:進樣量10μL.理論塔板數按青藤堿計算應不低于2000.
取干燥至恒重的青藤堿對照品2.82mg,精密稱定,置100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得.
精密吸取上述“2.2”項下的各方法精制樣品適量.甲醇溶解,定容至1000mL量瓶中,濾過,進樣.
精密吸取已制備好的對照品和“2.2.3”項下的樣品,照“3.1”項下色譜條件,各進樣 10μL,色譜圖見圖1.結果表明,樣品與對照品溶液均在相同保留時間內出現青藤堿吸收峰,說明本試驗條件下青藤堿峰與其他組分峰分離完全.
圖1 青藤堿HPLC圖譜
取青藤堿對照品精密稱定為4.46mg,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度作為儲備液(質量濃度為 0.446mg/mL).精密吸取 1、2、7、8mL置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得質量濃度為 0.0446、0.0892、0.3122、0.3568mg/mL 的對照品溶液及質量濃度為0.446mg/mL的儲備液,分別進樣10μL,測定峰面積,以對照品質量濃度(C)對峰面積(A)進行線性回歸,得回歸方程為:Y=9E+06X+102803(R=0.9999).結果表明,青藤堿在0.0446~0.446mg/mL質量濃度范圍內,線性關系良好.
精密吸取對照品溶液5份,按“3.2”項下條件測定,計算質量濃度及相對標準偏差.結果RSD=1.25%(n=5),表明測定精密度良好.
精密吸取按方法3項下條件制備溶液,分別放置 2、4、8、10、12 h,測定其峰面積,計算相對標準偏差.結果RSD=0.58%,表明樣品在放置12 h內穩定.
精密稱取對照品10.34mg,置10mL量瓶中,用甲醇溶解,作為儲備液.精密移取儲備液各1mL,分別置9個25mL量瓶中,分別稱取按方法3制備下樣品加甲醇溶解,定容至刻度,使體積分數成測定體積比的80%、100%、120%,各3份.進樣測定,計算測得量及回收率,平均回收率為99.5%,RSD為0.45%.
分別稱取青風藤藥材,各5 g,按“2”項下方法平行制成供試品溶液各2份,測定樣品中青藤堿的質量分數和轉移率.結果見表1.
表1 青藤堿的質量分數和轉移率的結果
本文參考相關文獻[3],單純用氯仿萃取(方法1),得到結果質量分數 35.38%,轉移率11.32%,得到青藤堿的質量分數和轉移率均較低,效果不佳;為了提高青藤堿的質量分數和轉移率,筆者在原有工藝的基礎上進行了改進和優化,選用在氯仿萃取基礎上,增加鹽酸水溶液的萃取(方法2),得到結果質量分數76.05% ,轉移率67.19%,結果有明顯改善,但仍不能達到較純精制;繼續增加氯仿、鹽酸水溶液的交替萃取(方法3),得到結果質量分數91.36%,轉移率79.78%,青藤堿的質量分數和轉移率都有了較大的提高.結果表明,隨著氯仿、鹽酸水溶液交替萃取次數的增加,青藤堿的質量分數逐漸上升,轉移率有所提高,因此,選用方法3為最佳的青藤堿精制工藝,該方法可行、可靠、可控,為青風藤及相關制劑的精制提供依據,為制藥新工藝的推廣和應用提供了科學方法.
采用高效液相色譜法建立了青風藤中青藤堿含量的測定方法,通過對方法的精密度、線性關系、回收率、穩定性等考察,驗證本法精密、準確,為青藤堿的質量標準研究提供了參考依據.
[1]劉 強,周莉玲,李 銳.青藤堿的研究概況[J].中草藥,1997,28(4):247.
[2]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(Ⅰ部)[S].北京:化學工業出版社,2005:135.
[3]劉超英,喬 明,范衛峰.青風藤中青藤堿的提取分離方法比較研究[J].湖北中醫學院學報,2005,7(1):49-50.