非甾體類抗炎藥NAG-1在胃癌中表達及意義

聶勝峰,蘭 斌,張 軍,曾志峰,丁 潔

(1.江西省新余市人民醫院普外科 338000;2.福建醫科大學附屬第一醫院胃腸外科二區 350005;3.江西省新余市人民醫院檢驗科 338000)

胃癌在中國的發病率居各種惡性腫瘤之首,年病死率約為25萬～10萬[1-2]。因此,其病因和預防是迫切有待解決的課題。有研究表明,非甾體類抗炎藥活化基因-1(NAG-1)在多種腫瘤中具有抑制腫瘤活性的作用,且在腫瘤細胞轉移、侵襲,以及新生腫瘤血管形成等各環節都發揮重要作用。本研究中,通過檢測NAG-1蛋白及mRNA在胃癌組織和正常黏膜組織中的表達水平,分析NAG-1基因與胃癌病理分型、分期、淋巴結轉移等臨床病理特征的關系,旨在探討胃癌發生、發展中的生物學意義及相關的分子病理學機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年 3月至 2010年5月新余市人民醫院外科手術切除(術前均未進行化療、放療及其他抗癌治療)的胃癌標本76例。其中男61例,女16例,年齡28～85歲,平均(62.00±11.08)歲,腫瘤浸潤至漿膜及以下39例,漿膜外有37例,有局部淋巴結轉移62例,未發生轉移14例。高、中分化39例,低分化、未分化為37例。根據國際抗癌聯盟(international union against cancer,UICC)標準,Ⅰ ～ Ⅱ期36例,Ⅲ～Ⅳ期40例。另取相應的距離腫瘤邊緣大于或等于5 cm處的正常胃黏膜組織作為對照。用于免疫組化的組織標本取出后,迅速用體積分數為10%的中性甲醛溶液固定,常規包埋,4 μ m厚切片。所有標本均經蘇木精-伊紅(hatmatoxylin,HE)染色,經病理檢查證實。用于RT-PCR的標本置于滅菌的錫箔紙內,液氮保存。

1.2 主要試劑 兔抗人GDF15(NAG-1)多克隆抗體(美國Abcam公司,ab14586),免疫組織化學試劑盒(福建邁新生物技術有限公司);Trizol、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒(美國 Invitrogen公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢測NAG-1 mRNA的表達 RNA提取和cDNA第1鏈合成按說明書上操作步驟進行。NAG-1引物序列上游:5′-CAG TCG GAC CAA CTG CTG GCA-3′,下游:5′-TGA GCA CCA TGG GA T TGT AGC-3′,β-actin 引物序列上游:5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′,下游:5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′;按以下反應條件在 PCR儀上進行擴增:94℃預變性5 min,94℃復性45s,62℃退火45 s,72℃延長1 min,共36個循環,72℃總延伸5 min。PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,100 V 25 min后,在長波紫外燈下觀察、照相。電泳結果用Quantity One分析系統進行電泳條帶分析,NAG-1產物與β-actin產物的比值為NAG-1 mRNA在組織中表達的相對量。

1.3.2 檢測NAG-1蛋白的表達 采用免疫組化SP法,NAG-1為即用型抗體,稀釋到1∶800,PBS代替一抗作陰性對照。操作按說明書進行。參照Birner等[3]的半定量評定方法,根據陽性細胞染色強度和陽性細胞所占百分比計分:無著色,即陰性者評為0分;著色弱,但明顯強于陰性對照者為1分;染色清晰者為2分;染色強者為3分。陽性細胞數＞10%～50%者為2分,＞50%～80%者為 3分,＞80%者為4分。兩項評分之和小于3分為陰性,≥3分為陽性。

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0軟件進行統計學數據分析,計量數據以±s表示;組間比較采用χ2檢驗和t檢驗,P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

胃癌組織中NAG-1蛋白的表達 光鏡顯微鏡下觀察可見NAG-1蛋白主要表達于正常胃黏膜的腺上皮細胞和胃癌細胞的細胞質,呈棕黃色。見表1,插Ⅳ圖1。NAG-1蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系見表2,插Ⅳ圖2。正常胃黏膜組織與胃癌組織中NAG-1 mRNA表達見表3,插Ⅳ圖3。

表1 胃癌組織和正常胃黏膜組織中NAG-1蛋白的表達比較

表2 胃癌組織中的NAG-1蛋白表達與臨床病理特征的關系

續表2 胃癌組織中的NAG-1蛋白表達與臨床病理特征的關系

表3 胃癌組織和正常胃黏膜組織中NAG-1mRNA的表達水平比較

圖3 胃癌組織和正常胃黏膜組織中NAG-1mRNA的表達

3 討 論

NAG-1屬轉化生長因子β1(tranforming growth factor β1,TGF-β)超家族的一成員,是由Beak等[4]用消減雜交法首先在人結腸癌細胞 HCT-116中獲得的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal aniinflammatory drugs,NSAIDs)誘導表達的基因。有研究表明,NAG-1在胎盤和前列腺癌中表達高[5],而在結腸癌中較正常腸組織表達顯著下降。也有研究顯示,NAG-1作為一種抑癌基因,能夠抑制乳腺癌和肺癌的形成,誘導腫瘤細胞凋亡[6-7]。

本研究結果顯示,胃癌組織中的NAG-1含量顯著低于正常胃黏膜組織(P＜0.05)。NAG-1不僅在胃癌組織中減少,而且與腫瘤的分化程度成反比,在分化程度高的腫瘤組織中,表達量明顯高于分化差的。結果與Kim等[8]研究結果相一致。有研究發現,NAG-1參與胃癌的發生、發展過程,可能在胃癌的侵襲和轉移中起重要作用,它可能成為早期診斷,判斷腫瘤進展程度,侵襲、轉移能力和預后的重要指標。目前對NAG-1在腫瘤組織中的表達是如何減少,使其具有抑制腫瘤的機制尚存爭議。有研究認為,可能是通過與p53作用實現。NAG-1作為p53下游的一個靶基因,其表達以依賴p53的方式調節[9]。結腸癌中突變型p53可導致NAG-1的表達下降,然而,在缺乏突變型p53的腫瘤組織中NAG-1表達亦減少,分析原因可能與多機制參與NAG-1的表達有關。

總之,對NAG-1表達的研究可成為治療胃癌的一個新的化學預防靶標,也提示對NAG-1蛋白的進一步研究可能有助于未來抗腫瘤藥物的開發。

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