姜黃素誘導HO-1表達對大鼠動脈粥樣硬化的影響*

劉全未,黃維義

(1.四川省內江市第二人民醫院心內科 641100;2.瀘州醫學院附屬醫院心內科,四川瀘州646000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發生機制十分復雜,多種危險因素如高血壓、吸煙、高血脂、糖尿病等均可通過促發氧化應激反應,導致血管內皮細胞損傷、低密度脂蛋白侵入內皮下間隙并在此被氧化修飾、單核細胞趨化聚集于內皮下并激活致血管壁慢性炎癥反應等,最終促發AS[1-2]。然而,同樣具有上述致AS高危因素的部分人群卻并不患病,表明人體內必然存在著有效拮抗氧化應激、防止AS的內源性保護機制。已知血紅蛋白氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)是HO的誘導型,HO-1/膽紅素/CO廣泛參與抗炎、抗多種急、慢性氧化應激損傷,在防治高血壓、AS等多種疾病中起重要作用,是機體內不可缺少的內源性保護系統[3]。近年發現,姜黃素是一種天然的HO-1強誘導劑,能誘導多種組織細胞高表達HO-1蛋白。本研究擬以姜黃素誘導HO-1的表達,探討其抗AS療效。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 姜黃素(美國SIGMA公司,純度99%),鋅原卟啉Ⅸ(美國SIGMA公司),維生素D注射液(上海通用藥業股份有限公司),膽固醇及膽酸鈉(上海藍季科技發展有限公司),丙硫氧嘧啶(上海朝暉藥業有限公司),HO-1檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 AS模型建立及動物分組 健康雄性Wistar大鼠(3月齡,體質量180～200 g,四川大學華西醫學動物中心提供)38只,適應性喂養1周后隨機分為 4組,即正常對照組(n=8只)、模型組(n=14只)、姜黃素組(n=8只)及抑制組(n=8只)。正常對照組全程普通飼料喂養,模型組、姜黃素組、抑制組在實驗開始時均一次性腹腔注射維生素D注射液70萬U/kg,同時姜黃素組加用姜黃素3 mg/kg,隔日腹腔注射1次,抑制組加用姜黃素同時予鋅原卟啉Ⅸ7.5 mg/kg,隔日腹腔注射1次,均予高脂飼料(膽固醇 3%,膽酸鈉 0.5%,丙硫氧嘧啶0.2%,白糖5%,豬油 10%,普通飼料 81.3%)喂養。于6、10及14周末分別處死模型組大鼠2只以了解AS形成程度。實驗時間14周。

1.3 病理形態觀察 14周末,苯巴比妥鈉腹腔麻醉后,分離主動脈并剝除外膜結締組織取降主動脈起始段1～2 cm置于10%中性甲醛溶液固定,常規石蠟切片及HE染色,光鏡下觀察血管內皮連續性及向管腔突出情況,血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC),泡沫細胞及血管內膜、中膜變化,并于多媒體彩色病理圖文分析系統測量內膜、中膜厚度及其比值。

1.4 斑塊面積測定 主動脈經10%中性甲醛溶液固定。常規脫色后用油紅O染色(斑塊部位著色),然后在多媒體彩色病理圖文分析系統分別測量斑塊面積和主動脈內膜面積。計算斑塊占主動脈內膜面積的百分比。

1.5 HO-1表達檢測 取大鼠降主動脈近段1～2 cm,行免疫組織化學染色(SABC)法檢查細胞內HO-1表達及分布情況。將大鼠主動脈用10%中性甲醛溶液固定后行石蠟包埋、切片,將切片常規脫蠟、至水,3%過氧化氫(H2O2)滅活內源性過氧化酶,經抗原修復、正常血清封閉后,滴加一抗(抗 HO-1抗體,滴度1∶200)及二抗(滴度1∶100);DAB室溫下避光顯色,脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察,見細胞胞質內有棕褐色顆粒物者即為HO-1蛋白表達陽性細胞。用CD-8病理彩色圖像分析系統在200倍光鏡下,對每張切片隨機測定5個不重復視野的HO-1蛋白吸光度(optical density,OD)值,取平均值代表 HO-1蛋白表達量。

1.6 HO-1活力測定 HO-1的活力測定參考姚海木等[4]的方法進行,取大鼠降主動脈近段約1～2 cm處組織制成10%組織勻漿,高速離心分離微粒體,考馬亮蘭法定量蛋白濃度;再根據HO-1降解血紅蛋白生成膽紅素的原理,以單位時間內每毫克蛋白催化反應體系中膽紅素的生成量代表HO-1活力,單位為nmol/(mg?h)。

1.7 統計學處理 應用SPSS13.0軟件行統計學分析。計量資料均以±s表示,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

光鏡下觀察,見正常對照組血管內皮完整、光滑;彈力纖維層結構清晰完整。模型組見動脈壁明顯增厚,管壁向管腔突出,內皮下可見大量泡沫細胞聚集,見表 1。HO-1表達量、分布及活力檢測見表2。

表1 4組內膜、中膜厚度比值比較(±s)

表1 4組內膜、中膜厚度比值比較(±s)

#:P＜0.05,與模型組比較;*:P＜0.05,與CMN組比較。

組別 n 內膜厚度(μ m) 內膜/中膜(%)正常對照組 8 8.81±1.57 8.70±1.6.00模型組 8 36.92±8.72 44.70±9.00姜黃素組 8 26.06±3.91# 35.50±5.80#抑制組 8 34.80±5.56* 45.00±10.20*

表2 HO-1蛋白OD值及活力檢測結果比較(±s)

表2 HO-1蛋白OD值及活力檢測結果比較(±s)

#:P＜0.05,與模型組比較;*:P＜0.05,與CMN組比較。

組別 n OD值 HO-1活力[nmol/(mg?h)]正常對照組 8 0.113±0.026 25.05±6.17模型組 8 0.271±0.05 35.46±3.17姜黃素組 8 0.448±0.078# 58.90±6.05#抑制組 8 0.213±0.038* 8.45±2.01*

正常對照組大鼠主動脈內膜無粥樣斑塊形成;模型組斑塊面積比值達(46.24±5.13)%,姜黃素組為(15.17±4.81)%,抑制組為(44.96±6.59)%。模型組的斑塊面積比值與抑制組比較無顯著變化(P＞0.05),但均明顯高于姜黃素組(P＜0.05)。

3 討 論

存在于細胞內微粒體中的HO系統可能是體內抗AS重要防御體系之一,是影響AS發生、發展的許多病理過程。作為血紅蛋白代謝的起始酶和限速酶,HO-1能降解血紅蛋白產生等摩爾的膽綠素、CO和游離鐵,其中膽綠素迅速被膽綠素還原酶還原成膽紅素。膽紅素具有強大的抗氧化﹑抗炎癥及抑制VSMC增殖等作用,而CO亦廣泛參與抗炎、調控細胞凋亡、抑制VSMC增殖。有研究表明,HO-1通過降解血紅蛋白所生成的產物發揮作用[5]。HO系統有可能通過對NO和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的調節及代償機制抑制AS的發展[6]。Yet等[7]利用腺病毒作為載體轉染 HO-1基因至載脂蛋白E基因缺失的小鼠,使VSMC HO-1高表達,有效阻止了AS的發生,反之,用錫原卟啉(Sn-protoporphyrinⅨ,SnPP)抑制HO-1的活力則能促進AS的發展;此外,Wang等[8]應用免疫組化染色和原位雜交技術證明實驗動物AS斑塊內、內皮細胞和VSMC內有HO-1表達的適應性增高,進一步研究發現,HO-1的過表達可減少斑塊形成,而使用HO-1的抑制劑如SnPP抑制HO-1活力則可促進斑塊的發生和進展[9]。以上研究均有力地證明了HO-1具有抗AS的作用。

姜黃素是從姜黃屬中藥如姜黃、郁金、莪術中提取的一種生物多酚化合物,可通過抗炎、抗氧化及清除自由基、抗凝、調脂等復雜的藥理作用有效拮抗AS的進程[10-13]。其藥理作用與HO-1廣泛的內源性細胞保護作用極其相似,因而推測姜黃素與HO-1兩者存在著某種內在的緊密聯系。新近不斷增多的證據表明,姜黃素的眾多藥理作用主要通過誘導HO-1蛋白表達實現,如姜黃素通過誘導大鼠VSMC HO-1蛋白高表達從而顯著抑制VSMC增殖[14-15]。有研究發現,姜黃素芳香環上的甲氧基是其誘導HO-1表達的活力部位[16],并可能是通過活化核因子相關因子2/抗氧化劑反應元件這一特殊的細胞內細胞信號轉導途徑而誘導HO-1的表達[17]。本研究結果顯示,姜黃素可顯著提高HO-1表達并增強其活力,有效減輕AS程度;同時應用鋅原卟啉Ⅸ可顯著抑制姜黃素對HO-1的誘導表達,其AS程度亦明顯加重。

姜黃素抗AS作用尚未完全闡明。本研究證實了姜黃素具有抗AS作用,亦證實了誘導HO-1高表達在姜黃素抗AS中的重要價值。為AS的防治提供了新思路,也為通過上調HO-1表達這一全新的方法防治AS奠定了有力的基礎,其作用與機制有待進一步研究。

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