乳酸菌酸脅迫應答機制研究進展

文 / 金君華 張 昊 郭慧媛 任發政 中國農業大學教育部功能乳品重點實驗室

1 概述

乳酸菌的特點是在其生長發酵時產生酸性的終產物，這些終產物的積累會改變其生長的外環境，使一些微生物難以適應，但乳酸菌可以依然存活。這一特點是許多食物可以通過發酵來保存的依據。另外，進入消化道后，乳酸菌要遭遇胃的酸性環境。但除了一些種屬外，如Lactobacillus，Leuconostoc和Oenococcus，乳酸菌都是嗜中性的，生長最適pH值在5～9之間。因此，人們對乳酸菌的耐酸性產生了極大的興趣。目前，有關乳酸菌酸脅迫應答機制的研究正在深入開展中。

2 乳酸菌的耐酸應答

已有的研究表明，至少有兩種不同的生理狀態可以提高乳酸菌的耐酸性。第一種是在對數生長期，通過非致死的pH值誘導產生耐酸應答（Acid tolerance response of lactobacillus，L-ATR）以提高耐酸性[1～4]；第二種是在進入穩定期后產生一般的脅迫應答（General stress response，GSR），提高耐酸性[5]。雖然在L.acidophilus CRL639中，需要較低的外界pH值才能產生GSR，但一般情況下GSR不依賴于外界環境的pH值。菌體形成生物膜可能是提高耐酸性的第3 種狀態，但這僅在變異鏈球菌中有報道[6～7]。大部分乳酸菌（除了L. lactis ssp. cremoris[8]）都擁有L-ATR能力，能夠通過這種應答能力來提高菌體在致死酸性環境中的存活力[2～4]。一般情況下，誘導的L-ATR不僅可以提高乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）的酸耐受性，還可以應對其它脅迫，例如高熱、高滲透壓或氧激[1]。L-ATR的這種寬范圍保護作用在不同種屬之間是不同的，對相同的脅迫不會都具有保護作用[9]。在L-ATR后，LAB的L-ATR的蛋白質組學研究表明，在L-ATR后，LAB所表達蛋白質的數目增多[10]，但是只有很少一部分假定的耐酸相關蛋白質被定性地研究過。

目前，已經在L.lactis 和S.mutans中開展了耐酸性的基因水平研究，得到了酸敏感突變株，并找到了酸調節啟動子；還通過基因手段實現了耐酸突變株的篩選?？傊?，生物化學、蛋白組學和基因分析表明，LAB的L-ATR是一個復雜的過程，它涉及到許多種蛋白質的合成和多種機制。

3 耐酸應答機制

3.1 維持胞內外pH值平衡

3.1.1 依靠ATP的質子輸出

如前所述，酸脅迫會導致橫跨膜pH值梯度的減小。LAB能夠在低pH值環境中維持一種寬范圍的△pH。一些乳酸菌，包括Lactococci可以維持其內部pH值接近中性，直到外界pH值下降到某閾值以下，內部pH值才開始下降。與其它LAB不同，L.delbrueckii細胞內的pH值與細胞外pH值同時下降，但維持胞內外△pH為1[1]。

（1）F0F1-ATPase

F0F1-ATPase在細菌中普遍存在，但還并不清楚它的分子結構和操縱子。該多聚體酶既能夠利用質子合成ATP，又能利用ATP水解提供的能量將質子運送出細胞。在LAB中，后者活性在低pH值環境中會升高，這對于維持△pH是至關重要的[1]。有研究表明，具有一定酸耐受性的Bifidobacterium lactis 和Bifidobacterium animalis，在較低pH值條件下H+-ATPase活性顯著增高[4]。目前已獲得許多F0F1-ATPase活性有缺陷的LAB突變株，并且這些突變株在低pH值環境中都表現出生長缺陷[1]。最近的研究表明，F0F1-ATPase除了具有電子轉移活性外，對于L.lactis的正常生長也很重要[11]。然而，F0F1-ATPase的活性具有一個缺點：它是消耗能量的，這最終可能將阻礙菌體在低pH值條件下的生長[12]。

目前，已有學者研究過編碼這種酶的一些操縱子（Operon）。ATP位點包含編碼細胞質F1復合物的5 個亞基（α，β，δ，γ，ε）及形成F0膜質子通道的3 個亞基（a，b，c）。在LAB中，atp操縱子具有與其它細菌不同的基因組成[1]，然而，這種差異的顯著性還不知道。在低pH值中，F0F1-ATPase活性的刺激可能是由于atp位點的轉錄子積累造成的（這在L.acidophilus和口腔鏈球菌研究中有報道），也可能是構成酶的亞基的穩定性造成的（這在E.hirae中有報道）。在所有的LAB研究中，L-ATR的2D蛋白質組學分析均表明，胞質F1復合物所有或部分亞基都呈現了上調表達[10]。但是在Oenococcus oeni中，ATPase的活性在低pH值中沒有顯著性地增加，但ATPase突變株的酸耐受性發生了改變。初步的結果表明，存在多個不同最適pH值的ATPase[13]。

（2）K+-ATPase

陽離子轉運ATPase，例如K+-ATPase在維持pH值的平衡中具有作用[1]。K+和H+的交換能夠使K+-ATPase產生的橫跨膜電勢（△?）轉化為橫跨膜pH值梯度（△pH）。這種離子的交換允許建立△pH，并且能夠參與到pH值平衡維持中。例如，生長在pH值為5.0的Streptococcus mutans中，葡萄糖供能的細胞能夠將細胞內pH值維持在5.5或者6.1。

3.1.2 基礎化合物的產生

（1）精氨酸脫氨基酶

pH值平衡的另一個機制就是精氨酸脫氨基酶途徑（Arginine deiminase pathway，ADI）。有3 種酶，即精氨酸脫氨基酶、鳥氨酸氨基甲酰轉移酶和氨基甲酸酯激酶構成了這個途徑，使精氨酸向鳥氨酸、氨水和二氧化碳轉化，并且1 mol精氨酸可形成1 mol ATP。生成的NH3與H+發生反應，利于堿化環境，產生的ATP能夠使F0F1-ATPase將質子運送出細胞外。另外，精氨酸/鳥氨酸的逆向轉運子允許這2 個分子在沒有任何能量消耗的狀態下實現交換。Marquis等人發現，在有45 mM的精氨酸存在時，L.lactis可以在幾個小時內將胞外的pH值從4.0提高到6.5[1]。ADI在許多LAB中都能檢測到，但是對于耐酸性的直接影響還沒有被報道。另外，已有研究顯示，與ADI調節直接相關的刺激因子應該是精氨酸的存在，能量的消耗，新陳代謝受到抑制，以及氧化作用[14～15]，而不是低pH值。因此，盡管ADI活性能夠堿化環境，但在不同菌種中，它對LAB耐酸性的重要性是不同的。

（2）脲酶

脲酶的活性可以在牛奶S.thermophilus和口腔細菌S.salivarius中檢測到。既然尿素在唾液中存在，那么尿素的分解對于S.salivarius在極端酸性環境中的生存就可能尤為重要，因此主要在后者中開展脲酶的研究。脲酶能夠催化尿素水解為CO2和氨水，這樣可以堿化環境，提高pH值。在有25 mM尿素存在的條件下，pH值3.0的細胞能夠將外界pH值提高到7.6，相對于沒有尿素的處理組，其存活率可提高1 000 倍[16]。通過過量消耗碳水化合物，復雜的尿素操縱子可以在低pH值環境中脫除阻遏。

（3）脫羧反應和電子轉運

在LAB中發現，脫羧反應和電子轉運的一些系統對于維持pH值平衡具有作用。在一些反應中，1 個羧基酸化合物（比如氨基酸）被轉運到細胞中，然后被脫羧。在反應中，1 個質子被消耗，然后產物通過轉運子被輸出細胞。這個反應最后可提高細胞質中的堿性。另外，通過脫羧反應和1 個電子轉運子可形成質子動力勢（Proton motive torce，PMF）從而產生ATP。這些反應與耐酸性的關系是在L.lactis中的谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，Gad）系統中建立出的。在氯化物和葡萄糖存在時，1 個gad缺失突變株的酸敏感性是野生株的1 000 倍[17]。Gad在腸道原核生物中是很常見的。有學者假設過這種酶的存在可使細菌通過胃環境時變得強大[18]。

蘋果乳酸發酵是雙羧基蘋果酸與單羧基乳酸之間的轉換。細菌產生的L-乳酸是通過乳酸-蘋果酸反向轉運子或電子單向轉運排出的，后者可以在低pH值中合成ATP。這種ATP產物很可能在O.oeni耐酸性中發揮作用[19]。

（4）終產物的電子轉運

已經研究過，L.lactis在中性和低pH值中排出的乳酸。在中性pH值條件下，排出過程是生電的，有利于PMF的產生；在低pH值條件下，這種轉運是電中性的，不利于膜電勢的產生。Koebman等人研究表明，L.lactis的F0F1-ATPase失效菌株不能在pH值7.0的培養基中形成菌落。這個發現表明，在中性pH值條件下，乳酸的排出不能產生足夠的能量來保證細胞的生長[20]。

3.2 細胞膜脂肪酸構成的變化

細胞膜很可能是生理脅迫的首要目標之一。細胞膜脂肪酸構成的變化是對環境脅迫的一般性應答。在E.coli中，脂肪酸修飾在保護細菌免受酸脅迫中發揮著重要的作用[21]。S.mutans可以對于適應酸化環境的原因之一是細胞膜上具有含量豐富的單不飽和長鏈脂肪酸，這使得細胞膜對于質子的通透性降低[22]。在S.mutans中，dlt操縱子的失活與脂磷壁酸的D-丙氨酸酯化反應有關，使生長狀態改變[23]。突變株比野生株更具有酸敏感性，這可能與高質子滲透性有關。在L.lactis中，某個與肽聚糖合成相關的青霉素綁定蛋白質的失活增強了酸敏感性[1]。這些數據表明，細胞壁的組成在酸耐受性上具有一定的影響，很可能是與細胞表面特性的改變有關，或者還有有利于維持酸脅迫環境細菌細胞壁完整性的其它系統存在。

首先，在O.oeni中，1 個小的熱激蛋白（smHSP）Lo 18，在熱處理、乙醇處理和酸處理后被誘導。原核生物的smHSP與有脊動物眼睛的α－晶狀體蛋白具有同一個保守序列。脅迫處理被誘導很可能與這個蛋白質在其它伴侶蛋白的共同作用下重新折疊成變性蛋白有關。有趣的是，Lo 18在熱脅迫之后可以變成主要的膜相關物質，可以被膜的流化作用誘導表達。這些數據表明，Lo 18可能與熱脅迫或酸脅迫后膜或壁蛋白的穩定性有關[24]。

第二，S.mutans的Ffh蛋白在耐酸性中發揮作用。在E.coli中，Ffh參與處理膜與胞外蛋白質運輸的信號識別粒子（Signal recognization particle，SRP）轉導路徑。在S.mutans中，ffh基因會被低pH值誘導上調表達。ffh突變株比野生株更具有酸敏感性，并且在酸脅迫中不能夠快速地提高F0F1-ATPase的活性[25～26]。這種表型或許反映了SRP系統在F0F1-ATPase轉導中的作用及其它酸誘導蛋白向膜內轉導的作用。

3.3 受損蛋白質的修復

除了可能發揮分子伴侶作用的O.oeni中的Lo 18和S.mutans中的Ffh蛋白外，在一些LAB的L-ATR的蛋白組分析中發現，熱激分子伴侶總是上調表達。這些蛋白質很可能是修復酸誘導損壞的蛋白質或輔助新合成蛋白質的折疊。盡管熱激蛋白DanK和GroEL一般會被鑒定出來，但在不同種屬中，酸誘導的熱激蛋白是不同的[3，10]。對S.mutan中的danK和groE操縱子進行的特異性研究結果表明，低pH值的誘導是由它們普遍的熱激調節子HrcA和CtsR中間介導的[5，27]。

3.4 受損DNA的修復

細胞內的酸化可引起DNA的脫嘌呤或脫嘧啶。這個機制與糖基鍵斷裂后的堿基質子化作用有關。參與堿基缺失的位點稱為堿基缺失位點（AP位點）。在L.lactis中，一個適度的UV輻射可以誘導提高針對多種脅迫的耐受性，包括酸脅迫，并且有4 種蛋白質在酸誘導中出現上調，它們都是由DNA損壞處理誘導的。這表明L-ATR或許含有DNA修復系統[28]，這種假設在S.mutans中得到驗證。在S.mutans中，L-ATR通過酸環境誘導了不依賴RecA的DNA修復系統，從而提高了菌體DNA對損壞的耐受性[9]。進一步研究表明，在低pH值下，野生型和recA缺失菌株S.mutans展現了針對AP位點的核酸內切酶活性，并且uvrA基因得到誘導表達[28]。uvrA突變株啟動完整的L-ATR保護的能力下降，并且在低pH值條件下，DNA降解的程度更嚴重一些[29]。Uvr系統是被DNA螺旋變形激活的，然而AP核酸內切酶活性通常通過堿基切除處理修復小的DNA損壞區域。因此，很可能在酸脅迫中2個系統共同工作。

3.5 耐酸系統的調節

雙組分系統通常與細菌對環境的適應有關。在L.lactis和L.sakei中，一些雙組分突變株展現了與耐酸相關的表型。雙組分系統在耐酸性中可能的相關性是表明酸度外部信號的存在[1]。一項最近的研究表明，S.mutans具有與群體效應感受相關的外部信號系統，這刺激了它的酸耐受性。盡管有能力的刺激因子參與到了信號中，但仍需要另一因子來獲得完整的耐酸誘導。一些胞內系統能夠在酸或其它脅迫的耐受性的控制中發揮一些作用[6]。L.lactis的高親和度磷酸轉運子的失效突變株對于H2O2和酸性pH值具有很高的耐受性[30]。很可能像在B.subtilis中研究結果一樣，磷酸限制誘導了包括脅迫耐受基因的調節子[31]。既然之前的研究表明低pH值能夠降低磷酸轉運子的活性，那么磷酸控制調節子很可能在L-ATR中發揮著作用。在L.lactis中，與鳥嘌呤核酸代謝有關的基因guaA（GMP synthetase）和relA[（p）ppGpp synthetase]失活，導致菌株對酸、熱激和葡萄糖營養饑餓耐受性的提高[30]。在S.mutans中，SGP（Streptococcus GTP-Binding protein）蛋白與GTPase的普遍Era亞家族具有同源性，或許與酸耐受性有關[32～33]。SGP的可能功能之一就是調節GTP/GDP系統。值得注意的是，SGP的表達量和它與膜的相關性在脅迫的環境下同時升高。因此，可以提出假設：作為脅迫感受器的核糖體[34]，可根據它的活性調節（p）ppGPP合成RelA[1]，及感受或調節GTP/GDP比例的SGP是進行完整調節管理的作用者[33]。

4 展望

由于乳酸菌具有的較高的工業應用價值，有關乳酸菌在各種環境中的脅迫反應機制已成為研究的焦點之一。隨著新技術在基因和蛋白質研究領域的應用，乳酸菌酸脅迫反應機制研究將取得更大的進展。

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