反相高效液相色譜法測定食品中的多種黃色工業染料

楊 琳，陳青俊，丁獻榮，汪慶旗，徐雙陽

（浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州310009）

反相高效液相色譜法測定食品中的多種黃色工業染料

楊 琳，陳青俊，丁獻榮，汪慶旗，徐雙陽

（浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州310009）

食品中的非食用色素工業染料經無水乙醇超聲振蕩數次提取，于45℃真空濃縮，高速離心，采用HPLC系統用20mmol/L醋酸銨溶液和甲醇梯度洗脫，在二極管陣列檢測器430nm和480nm下檢測，用外標法峰面積定量。結果顯示：五種工業染料在0～20.0μg/mL濃度范圍內的峰面積與濃度的線性關系良好；加標回收率為90.9%～98.9%。該方法簡便易行，準確可靠。

堿性橙嫩黃O，堿性橙2，堿性橙21，堿性橙22，酸性間胺黃，高效液相色譜，二極管陣列檢測器

近年來，隨著我國經濟的飛速發展，食品安全問題越來越受到人們的重視，但是卻有一些不法商販為了一己私利，為了增加食品的色澤光亮，以次充好，在鮮海魚、豆制品、腐竹等食品中使用黃色的工業染料，這類工業染料大都屬于偶氮類染料，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色，已經被認定是一種可以使人致癌的物質，不得用于與人體長期直接接觸的紡織和服裝產品中，根據《中華人民共和國食品添加劑使用衛生標準》及《中華人民共和國食品衛生法》的相關規定，為禁止用作食品添加劑的化學制品。目前工業染料的品種繁多，就需要建立一個快速準確測定食品中多種工業染料的方法。本方法針對市場上曾經出現過的五種常用的黃色工業染料：堿性嫩黃O，堿性橙2，堿性橙21，堿性橙22，酸性間胺黃，從研究工業染料的提取、富集等前處理條件，運用高效液相色譜分離，利用DAD二極管陣列檢測器進行檢測，建立了一套適合實驗室快速準確測定食品中多種黃色工業染料的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 色譜純；標準品堿性橙嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性間胺黃 含量≥99%，sigma；標準儲備液 分別準確稱取0.1000g五種工業染料標準物質，用50%甲醇水溶解并定容到100mL，配成濃度為1.00mg/mL的儲備液；測定前將儲備液稀釋50倍到20μg/mL，此為標準工作液；醋酸銨，無水乙醇。

高效液相色譜儀 125雙溶劑泵，168二極管陣列檢測器，508自動進樣器，32Karat數據工作站；超聲波振蕩器，高速離心機（16000r/min），旋轉蒸發儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 稱取20g左右（準確至0.01g）均質樣品，置于150mL燒杯中，加入2g無水硫酸鈉攪拌均勻，加入30mL無水乙醇超聲提取15min，將提取液用濾液過濾到圓底燒瓶里，再加入30mL無水乙醇，重復上述操作三次，合并提取液，于45℃真空濃縮至近干，氮氣吹干后用流動相洗脫并定容至5mL容量瓶中，樣液用高速離心機12000r/min離心10min，取上清液待測。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱（4.6× 150mm，5μm）；流動相：0.02mol/L醋酸銨緩沖液和甲醇按以下梯度洗脫：0～8min，甲醇 11%～65%；8～14min，甲醇65%～73%；16～18min，甲醇73%～100%；20～24min，甲醇100%～11%；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：430nm（堿性橙嫩黃O、堿性橙2、酸性間胺黃），480nm（堿性橙21、堿性橙22）。

1.2.3 吸收波長的選擇 分別取適量的標樣用50%的甲醇水溶液溶解，配制成濃度為10μg/mL的溶液，采用二極管陣列檢測器在190～600nm范圍內進行在線光譜掃描。

2 結果與討論

2.1 吸收波長的選擇

各標準品的二極管陣列檢測器190～600nm范圍內的光譜掃描圖如圖1～圖5所示。由圖可知，堿性橙2的λmax=439nm（圖1），堿性橙嫩黃O的λmax= 430nm（圖2），酸性間胺黃的λmax=430nm（圖3），堿性橙21的λmax=485nm（圖4），堿性橙22的λmax= 485nm（圖5）。為了可以同時測定多種黃色工業染料，達到最佳的靈敏度，本實驗綜合考慮選擇波長430nm和480nm為檢測波長。

圖1 堿性橙2的光譜掃描圖

圖2 堿性橙嫩黃O的光譜掃描圖

圖3 酸性間胺黃的光譜掃描圖

2.2 標樣圖譜

在1.2.2色譜條件下，標樣圖譜見圖6和圖7。按照色譜峰的保留時間定性，外標法峰面積定量。

2.3 樣品預處理條件的選擇

2.3.1 提取時間的選擇 為研究提取時間對樣品中工業染料測定值的影響，分別考察了10、15、20min的提取率。實驗結果表明，隨著提取時間的增加，樣品中工業染料的測定值有所升高，但提取時間為15min和20min重復提取三次，測定值幾乎無差別，因此選擇提取時間為15min。

2.3.2 濃縮方式的選擇 為了提高方法的檢出限，樣品要經過濃縮，采取了水浴蒸干和低溫真空濃縮兩種方法，實驗結果見表1。

圖4 堿性橙21的光譜掃描圖

圖5 堿性橙22的光譜掃描圖

圖6 掃描范圍168～430nm

圖7 掃描范圍168～480nm

表1 不同濃縮方式回收率結果（%，n=3）

實驗發現，堿性橙2和堿性橙嫩黃O受溫度的影響很大，當采用水浴蒸干時，過高的溫度使堿性橙2和堿性橙嫩黃O回收率很低；堿性橙2和堿性橙嫩黃O在50℃以上容易分解，低溫真空濃縮可以得到比較高的回收率，但是過低的溫度需要花費很長的時間，濃縮的效果也欠佳，本實驗采用了45℃真空濃縮，可以達到比較滿意的效果。

表2 回歸方程、檢出限及回收率結果

2.4 線性關系、檢測限、精密度和回收率

五種工業染料的定量標準曲線、檢測限、精密度和回收率見表2。

2.5 干擾性實驗

在本研究方法的色譜條件下，食品中常見的添加劑苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、咖啡因在430、480nm幾乎無吸收，不會干擾堿性橙的測定；食品中常見的食用色素檸檬黃、日落黃的保留時間分別為4.2、7.3min（色譜圖見圖8），均不干擾堿性橙嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22，酸性間胺黃的測定。

3 結論

稱取20g左右的樣品，經無水乙醇超聲振蕩數次提取，于45℃真空濃縮，高速離心，上清液進HPLC以20mmol/L醋酸銨溶液和甲醇梯度洗脫，在二極管陣列檢測器430nm和480nm下檢測，用外標法峰面積定量。五種工業橙染料在0～20.0μg/mL濃度范圍內的峰面積與濃度的線性關系良好；方法的最低檢測限堿性橙嫩黃 O為 0.1μg/mL，堿性橙 2為 0.1μg/mL，堿性橙 21為 0.1μg/mL，堿性橙 22為0.1μg/mL，酸性間胺黃為 0.1μg/mL（以進樣濃度計）；方法的回收率為90.9%～98.9%?？傊?，本方法用于食品多種工業染料的測定，具有準確、快速、簡便等優點。

圖8 8種混合標準溶液色譜圖（Det 168～430nm）

［1］鐵曉威，黃百芬，任一平.RP-HPLC法測定染色黃魚中堿性橙含量［J］.中國衛生檢驗雜志，2004，14（1）：59-60.

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RP-HPLC determination of five kinds of yellow industrial dyes in foods

YANG Lin，CHEN Qing-jun，DING Xian-rong，WANG Qing-qi，XU Shuang-yang
（Zhejiang Gongzheng Testing Center Inc.，Hangzhou 310009，China）

A method for determination of inedible industrial colorants in foods by high performance liquid chromatography（HPLC）was established.Samples were extracted by anhydrous alcohol using ultrasonic.The extraction was concentrated in vacuum and 45℃，then analyzed by HPLC with 20mmol/L ammonium acetate and methanol，detection wavelength were 430nm and 480nm.The results showed thatindustrial dyes in the concentration of 0～20.0μg/mL had good linearity with peak area.The recovery rate with standard addition was 90.9%～98.0%.The method was simple，feasible and accurate.

auramine O；chrysoidine G；astrazon Orange G；astrazon Orange R；metanil yellow；HPLC；DAD

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0350-03

2010-02-01

楊琳（1979-），女，在讀碩士，工程師，研究方向：食品中微量元素測定和高效液相色譜的分析。