阻抗法檢測食品中微生物的研究進展

張愛萍，唐佳妮，劉東紅

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310029）

阻抗法檢測食品中微生物的研究進展

張愛萍，唐佳妮，劉東紅*

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310029）

阻抗法作為微生物快速檢測方法，可用于食品中菌落總數、大腸菌群、霉菌、酵母等常規微生物的快速檢測；隨著研究的深入，其在食品病原菌快速檢測中也大有前景。綜述了傳統阻抗微生物檢測的發展歷程及阻抗法最新研究方向，旨在為今后阻抗法快速檢測食品中微生物的研究奠定基礎。

阻抗，微生物，歷程，趨勢

微生物是食品檢測中的一項重要指標，近年來食品安全問題的凸顯，研究和建立食品微生物快速檢測方法以加強對食品衛生安全監控越來越具有現實意義。而阻抗法在微生物快速檢測應用中具有檢測快速、操作簡單、檢測成本低等優勢，迎合了食品企業內部及監管部門對食品質量安全及時監控掌管的需要。阻抗檢測的具體操作：在無菌條件下，將被測食品樣品加入到含有一定量、無菌的培養介質（固體/液體）的阻抗測試管內（見圖1），插入電極；然后在兩電極之間通以一小振幅交流電，測量兩電極間阻抗值（電導值、雙電層電容值、總阻抗值）變化［1-4］。其依據的原理：微生物在培養介質中生長代謝，會將大分子、電惰性的營養物質代謝分解為小分子、電活性物質，改變培養介質的阻抗特性，導致培養介質的阻抗值發生改變；從微生物接種之時起至培養介質產生可檢測的阻抗變化所需要的時間稱為檢出時間（DT），研究表明DT值跟培養介質中微生物的初始濃度的對數值（lgN0）存在著一定的相關性，微生物初始濃度小的其DT值大，反之則??；在檢測之前，建立lgN0跟DT值之間的標準曲線，根據檢測到的被測微生物的DT值實現微生物數目的間接測量，據此實現微生物數目的快速測定［5-8］。而阻抗法對微生物鑒定則是依據同一微生物在不同培養基中具有不同的代謝形式，不同種類的微生物在某一特定的培養基中的阻抗變化曲線也不同，據此可實現微生物的快速鑒定［9-11］。因目前用阻抗法進行微生物種類鑒定還需要采取純培養方式，對與混雜培養的微生物還不能進行鑒別，需先進行分離純化，才能進行種類的鑒別，所以研究較少［11］。目前，阻抗法在微生物檢測中的應用主要集中在快速檢測食品中微生物的數目。本文對阻抗法檢測微生物的發展歷程及最新研究內容作簡要綜述，為今后阻抗微生物的研究奠定基礎。

圖1 阻抗測試管

1 阻抗法的發展歷程

1898年，Stewart GN在實驗中發現微生物的生長會導致培養介質電導率的改變，并在隨后的英國醫藥協會會議上提出了阻抗微生物的概念［12］，這就是阻抗法首次提出。之后，阻抗法在微生物檢測中的應用一直未引起人們的重視。直到20世紀70年代，因傳統的微生物檢測費時、費力；同時，可用于微生物快速檢測的商業化阻抗儀的出現，研究人員開始將目光投注于阻抗法在微生物快速檢測中的應用。Ur A等研究了阻抗變化值與培養介質內微生物數目變化的關系、不同微生物在同一培養介質中的阻抗變化曲線、同一微生物在不同培養介質中的阻抗變化曲線、微生物初始值不同的阻抗變化曲線、Escherichia coli在含不同劑量抑菌劑的培養介質中的阻抗變化曲線，研究結果表明阻抗法可用于抑菌劑的抑菌效果及抑菌劑的檢測、微生物的快速鑒定、微生物初始數目的快速分析［10］；1977年，Hardy D等首次將阻抗法用于冷凍蔬菜的微生物污染水平的檢測：分別用阻抗法和平板計數法檢測357個樣品的微生物的污染水平是否大于105CFU/g，得到阻抗法的準確率高達92.6%［6］。隨后，Richards JCS等、Cady P等通過較系統的研究也都證明了阻抗法可用于食品中微生物的快速測定［13-14］。各研究人員通過研究也證明阻抗法可用于肉類［15］、牛奶［16-17］、果汁［18］等食品的微生物數目的快速分析。因阻抗法檢測微生物是通過檢測培養介質阻抗值的變化實現微生物快速分析，有些培養基雖然適合微生物的生長代謝，但是其生長代謝導致的相應的阻抗變化卻不明顯。這就要求阻抗培養介質不僅適合于微生物的生長，而且要求能產生相應顯著的阻抗變化。為了對阻抗法檢測過程中培養介質配方的選擇更有方向性——既有利于被測微生物的選擇性生長、又能產生顯著的阻抗變化，Owens JD研究了各營養物質（蛋白質、脂肪、糖類等）對檢測過程中阻抗變化的影響進行了深入的研究［19］。

酵母和霉菌，其代謝不僅不產生強離子代謝產物，相反會產生非離子代謝終產物（如乙醇），就無法通過改良培養基的配方來實現阻抗檢測，限制了阻抗法在食品檢測中的應用。針對這種情況，1989年Owen JD等提出間接阻抗法，即利用微生物生長代謝產生的二氧化碳導致堿性吸收溶液阻抗值的變化來實現微生物數目快速分析［20］，大大擴寬了阻抗法在食品微生物檢測中的應用范圍。間接阻抗法與之前的阻抗法不同之處在于：含堿性吸收液的測試管與含微生物的培養介質試管相通，含堿性吸收液吸收微生物生長代謝產生的二氧化碳，通過檢測含堿性吸收液的測試管內的阻抗變化實現微生物快速分析，區別于直接阻抗法直接檢測微生物培養介質的阻抗變化。Madden RH等分別用直接阻抗法和間接阻抗法檢測食品中的沙門氏菌，得到間接阻抗法陽性結果的檢出率比直接阻抗法高30%［21］。

除了阻抗法在微生物快速檢測中的應用的研究外，也有一些研究人員專注于阻抗法檢測過程中各阻抗成分變化及等效電路的研究。Hause LL等早在1981就指出兩電極間的總阻抗值可分為培養介質電導和電極阻抗，并且在低頻條件下微生物生長代謝引起阻抗虛部值的變化在總阻抗值的變化中占主導［22］。Felice CJ等認為阻抗測試管的阻抗成分可分為電極——培養介質界面阻抗和培養介質電導，而界面阻抗又包括界面電阻和雙電層電容，整個等效電路由界面阻抗和培養介質電阻串聯而成［23-24］。隨著對阻抗法檢測過程中阻抗成分變化研究的深入，研究人員開始研究不同阻抗成分（電導值、雙電層電容值、總阻抗值）在微生物快速檢測中的應用：Felice CJ等分別用雙電層電容值、培養介質電導值作為阻抗檢測參數檢測牛奶中的菌落總數，得到雙電層電容值在檢測過程中的變化幅度更大，與平板計數法的相關性更好［25］；Flint SH等分別用電極阻抗、培養介質阻抗檢測嗜熱脂肪芽孢桿菌及其芽孢體的數目，發現只有電極阻抗值可用于這兩種菌體形態數目的快速檢測［26］。

在上述的阻抗法檢測微生物的研究中，需要將被測食品樣品加入到無菌培養介質中。為簡化阻抗檢測的操作，近年來，已有研究人員用檢測電極直接檢測被測樣品的阻抗值來實現菌落總數的快速測定。其具體操作：檢測電極直接浸入到被測樣品中，記錄阻抗變化，得到DT值，再由事先制得的標準曲線得到樣品中的菌落總數。該操作不需要將被測樣品加入到另外的無菌培養介質，比之前的阻抗檢測法更易實現自動化，更符合食品工業的應用要求［27］。Grossi M等將金屬電極直接插入冰激凌樣品中進行阻抗檢測，將得到的檢出時間與樣品中初始菌數做回歸，得到回歸方程：y=555.7-28.987lnx，R2= 0.7794，其中y的單位為min，x為菌落總數［28］。

2 阻抗法發展新趨勢

2.1 微電極體系

微加工技術的發展，使得相互交叉微電極體系（IME，見圖2）替代傳統的檢測電極開始應用于阻抗微生物檢測中。IME跟普通檢測電極類似，由陽極、陰極組成；但其陽極、陰極上帶有多個指狀電極，這些指狀電極相互交叉，形成許多個電極對，每個電極對之間的距離通常在1～10μm，甚至能達到納米級。IME的這種構造導致了通過電極的電流基本都分布在電極表面，這使得IME對電極表面的阻抗變化非常敏感；同時，因IME陰、陽極之間的距離很近，造成整個電極附近電場強度很大，使得IME的檢測靈敏度很高［8，29］。Yang LJ用IME檢測含微生物菌懸液中微生物數目，發現微生物數目在106～1010CFU/mL范圍內跟阻抗值存在著線性關系，其R2高達0.98［30］。Yang LJ等、Varshney M等分別用IME檢測食品中的沙門氏菌、病原性大腸桿菌，也都得到很好的檢測結果［31-32］。

2.2 阻抗免疫傳感器

阻抗免疫傳感器利用IME對電極表面的阻抗變化高度敏感的優勢，將阻抗法跟免疫學原理結合應用于食品中病原菌的快速檢測。其具體操作：將對應于被測病原微生物的抗體采用特定的固定化技術固定在電極表面，利用抗原抗體免疫反應將被測微生物捕獲，不同濃度的被測微生物其阻抗響應不同，據此實現病原菌的快速定性、定量分析［33-35］。目前，阻抗免疫傳感器可用于檢測食品中的致病性大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌等［36-38］。Radke SA等用自制的阻抗生物傳感器對含大腸桿菌的食品樣品進行檢測，得到該阻抗傳感器可用于含104～107CFU/mL致病性大腸桿菌食品的快速檢測［39］。Nandakumar V等，用自制的阻抗生物傳感器檢測食品中的沙門氏菌，結果表明該法可用于食品中沙門氏菌的快速檢測［40］。

為了使阻抗免疫傳感器的檢測靈敏度更大，在制作阻抗免疫傳感器過程中，除了將對應于被測病原菌的抗體固定在IME上，同時將一些標記物（如堿性磷酸酶）固定于IME上，用于增大阻抗微生物的檢測過程中抗原——抗體免疫反應的響應信號［34］。

圖2 相互交叉微電極

2.3 介電泳技術在阻抗檢測中的應用

在阻抗檢測過程中，除了阻抗法與免疫學原理的結合，介電泳技術也開始應用于阻抗檢測。含被測微生物菌懸液在介電泳的作用下，依據其電學特性在檢測管道內得到富集，然后再用IME進行阻抗檢測［41-42］。Varshney M等用自制的檢測裝置檢測牛肉中的病原性大腸桿菌，整個裝置由流動池及檢測池組成。在流動池內分布有帶磁性的大腸桿菌抗體，樣品注入該池，在介電泳的作用下被相應的抗體捕獲，同時其余雜質則在介電力的作用下被洗脫，含大腸桿菌液體注入檢測池內進行阻抗檢測［43］。

3 結論

阻抗法是為數不多的可區分死菌、活菌的微生物檢測方法，這對于食品安全具有重大意義。IME在阻抗檢測中的應用，使得阻抗微生物檢測越來越趨于微型化，同時大大提高了阻抗檢測的靈敏度。免疫學原理與阻抗法的結合，解決了阻抗法在病原菌快速檢測中應用的難題。介電泳技術在阻抗檢測中的應用使得阻抗法在線檢測食品中病原菌成為可能。

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Research progress in the impedance method in the detection of microorganisms in food

ZHANG Ai-ping，TANG Jia-ni，LIU Dong-hong*
（College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China）

As a rapid detection method of microorganisms，the impedance method can be used to rapidly detect the total number of colonies，coliform，mold，yeast，and so on.There is great prospect for the rapid detection of pathogens in food as the research of the impedance method developed.The development of the traditional impedance method and the latest research of the impedance method were reviewed，aimed at the future research of the impedance method for rapid detection of microorganisms in food.

impedance；microorganism；development course；trend

TS201.3

A

1002-0306（2011）02-0436-04

2010-03-17 *通訊聯系人

張愛萍（1985-），女，碩士研究生，主要從事微生物快速檢測的研究。

十一五國家科技支撐項目（2006BD04A08）。