拉曼光譜在頭頸腫瘤外科中的應用

李龍江 閆 冰 李 一

目前對絕大多數腫瘤的臨床診斷而言,組織病理診斷仍是金標準[1]。但是,隨著臨床腫瘤治療和研究的不斷發展,傳統病理診斷也顯現其一些不足,如無法實時快速診斷,需要對樣品標本進行染色處理及僅能對形態學發生改變的組織進行診斷等,這些都影響了臨床對腫瘤的早期快速的診斷及治療。隨著光譜學在生物醫學領域研究的不斷深入,其臨床應用價值受到越來越多的關注,而拉曼光譜是近年來研究的熱點之一。拉曼光譜不僅可以應用于臨床疾病的診斷,還可應指導臨床的治療以及應用于一些疾病預后的判斷。本文通過復習相關文獻,對拉曼光譜在頭頸腫瘤外科中的應用進行綜述。

一、拉曼光譜的原理

當一束單色光射向標本組織時,一部分被反射,另有一部分在穿越組織時會與其相互作用,產生四種情況:①彈性散射;②吸收;③產生熒光;④非彈性散射[2]。根據量子力學理論,在光子進入被照射的組織內,處于基態的分子吸收一部分光子的能量后躍遷至能量級更高的虛態,但虛態是一種不穩定狀態,處于虛態的分子會立即發射光子回到較低能量級或基態,從而導致了這部分光子的能量與入射光子不同,其光線的波長也相應地發生了改變,即產生了非彈性散射[2]。這一現象最早是由印度科學家 Raman于1928年發現的,因此非彈性散射又被稱為拉曼散射,而利用拉曼散射光線得到的光譜稱為拉曼光譜[2]。拉曼散射中非彈性散射后的光線波長發生了改變,在拉曼光譜中是以波數差的形式表現,而每條分子鏈在拉曼光譜上都有特征性的波數差,可以根據拉曼光譜波數差來了解樣本內分子的組成、分子的結構及分子之間的相互關系等豐富的信息,因此拉曼光譜又被稱為“分子指紋”[3]。

二、拉曼光譜在疾病診斷中的優勢

在病變組織中,即使在細胞尚未發生鏡下可見的形態學改變之前,由于細胞增殖、分化或惡變以及一些活性因子的分泌等都會引起組織中 DNA、RNA、蛋白質和脂類的結構、成分和含量的改變,而拉曼光譜可以檢測出樣本中此類物質的改變,對腫瘤等疾病早期診斷具有傳統病理學診斷所不具備的優勢[4,5]。同時,相對傳統病理學對組織標本的繁瑣處理過程,拉曼光譜可以實時、無創、快速地對疾病進行診斷檢測,其樣本無需特殊處理,方便快速,可以反復使用[6,7]。再有,某些疾病位于特殊解剖部位而無法或不宜活檢,隨著光導纖維在拉曼光譜中的應用,拉曼光譜可以對這些部位的疾病進行無創的活體診斷檢測[6～8]。此外,拉曼光譜不僅可以對疾病診斷進行定性分析,還可以對樣本組織中的成分改變進行定量分析,這對判斷預后及疾病分期具有重要意義。相比熒光光譜和紅外光譜而言,拉曼光譜具有無需樣本預處理、對樣本損傷小、穿透度深、光譜分辨率高等優點,同時其譜帶相對窄,不易重疊,能夠提供更多的樣本信息,有利于分析[5,7]。

三、拉曼光譜在頭頸部腫瘤診斷中的應用

目前,光譜學由于具有實時、無創和原位鑒別診斷的優勢,越來越多地被應用于頭頸腫瘤診斷的研究[1]?；准毎┦且环N最常見的皮膚惡性腫瘤,多發生在頭頸部[9]。Nijssen等[9]選用波長為 850nm的激光,分別對手術切除的 15例經病理診斷證實為基底細胞癌的樣本組織中病變部位和正常皮膚進行照射,通過 10s收集信號獲得相應的拉曼光譜。通過對光譜數據分析,拉曼光譜對基底細胞癌的診斷靈敏度可以達到 100%而特異性為 93%。David等[8]對鼻咽部黏膜的癌變組織和正常組織的拉曼光譜分析比較發現,癌變組織與正常組織分別在 1290～1320cm-1,1420～1470cm-1和1530～1580cm-1等3處波數差存在統計學差異。Das等[10]利用 830nm激光對 9例甲狀旁腺腺瘤樣本及 6例增生樣本中的焦點區域進行照射,共收集 698個拉曼光譜。通過比較兩者的平均光譜發現,二者雖然相似,但在酰胺鍵、脂類、DNA和蛋白質等某些特定波數差處存在不同,建立線性差異分析方法的預測模型可以很好地將兩者進行鑒別,其特異性和靈敏度均達 90%以上。

口腔癌是頭頸部十大惡性腫瘤之一,其發病率和病死率在頭頸部惡性腫瘤中較高,5年生存率據報道約為 55%,能否早期診斷是其預后的關鍵[11]。Oliveira等[11]和 Malini等[12]通過對口腔黏膜組織切片的拉曼光譜研究發現拉曼光譜可以很好地區分正常組織、炎癥組織、癌前病變組織和癌變組織。Schut等[13]首次利用拉曼光譜對活體小鼠口腔上腭黏膜進行研究,結果表明拉曼光譜對上腭黏膜各種程度的非典型增生及原位癌具有良好的鑒別能力,靈敏度和特異性均在 90%以上,特別是對原位癌和重度非典型增生的鑒別靈敏度和特異性均為 100%。Li等[14]以1064nm波長激光為激發光,分別獲取了正?？谇火つ?、口腔白斑及口腔癌的特征拉曼光譜各 60例,通過對比研究發現,在口腔癌和白斑組織中的蛋白質、DNA及脂質的含量均高于正?？谇火つ?。通過分類模型的分析可以準確地鑒別不同組織的拉曼光譜,特別是口腔癌與正?？谇火つよb別的準確率、特異性及靈敏度均達到了 97%以上。

血液是最早應用于診斷學研究的體液,它反應人體內環境的代謝水平,可以用于多種疾病的診斷。Andrew等[15]利用拉曼光譜技術對 20例頭頸部腫瘤患者(絕大多數為鱗癌患者)的血清進行研究,以 20例呼吸系統疾病患者的血清作為對照,通過主成分分析及線性判別函數(PCA-LDA)相結合的方法進行分析,發現通過拉曼光譜可以較好地鑒別區分頭頸部腫瘤患者及對照組患者的血清,其準確度為 65.8%,靈敏度為 64.9%,特異性 66.7%。而一項對鼻咽癌患者血清拉曼光譜的研究發現,表面增強拉曼光譜可以很好地提高血清的拉曼光譜信號強度,更好地反映出鼻炎癌患者血清與對照正常血清之間的差異。在鼻咽癌患者血清與正常血清的拉曼光譜比較中,鼻咽癌患者血清的拉曼光譜中 725、1330、1445和1580cm-1對應的譜峰較高,表明其核酸、蛋白質及脂質的含量較高,而正常血清拉曼光譜中 638、813、886和 1134cm-1對應的譜峰較高,表明正常血清中的酪氨酸、乳糖、絲氨酸、谷胱甘肽及甘露糖的含量較高。通過 PCA-LDA分析,鑒別診斷的準確率達 95.4%[16]。

四、拉曼光譜診斷頭頸部腫瘤治療并發癥的應用

放射性骨壞死或骨髓炎是頭頸部惡性腫瘤經過放射治療后最嚴重的并發癥之一,組織病理學表現為骨組織缺氧、血管減少和細胞壞死。臨床上如果能在早期原位鑒別出壞死和正常骨組織就可以減少骨組織的切除范圍,減少患者痛苦,為后期修復手術創造便利。

Barbara等[17]分別對發生過骨折的股骨頭組織標本及正常的股骨頭組織標本的拉曼光譜研究發現,發生過骨折的標本其骨組織成分與正常組有明顯差異,表明拉曼光譜可以鑒別骨組織內的病理生理改變。Draper等[18]利用時間分辨技術穿透皮膚的拉曼光譜對小鼠活體的骨骼進行檢測,發現所得到的光譜與直接暴露的骨骼光譜相似。該技術是在普通拉曼光譜儀中加入 4ps間隔的濾波器,將首先由皮膚和肌肉散射回到探頭的拉曼光過濾掉,而只接收更深部位散射回來的拉曼光譜[18]。這項技術的應用,使得拉曼光譜應用于臨床檢測體內深部組織或器官如骨骼組織等成為可能。

Lakshmi等[19]在對下頜骨放射性骨壞死的研究中,發現拉曼光譜對骨組織中礦物質和有機物等成分的改變敏感,可以用來評價其有機和無機基質的破壞或改變。Lakshmi等將實驗樣本分為正常骨組織、放射治療后正常骨組織和發生放射性骨壞死的骨組織3組進行光譜研究,拉曼光譜顯示發生放射性骨壞死樣本的無機基質結構發生改變,膠原蛋白變性,成骨細胞和破骨細胞減少,將所得的拉曼光譜通過主成分分析法(PCA)進行計算,結果表明 3組之間的拉曼光譜存在明顯差異,即拉曼光譜可以很好地鑒別經過放射治療的骨組織是否發生放射性骨髓炎或骨壞死。

五、拉曼光譜的應用前景

拉曼光譜技術在頭頸腫瘤外科中的應用,不僅包括頭頸部腫瘤的早期診斷和放射性骨壞死的鑒別,還可以輔助確定惡性腫瘤手術切除的范圍、移植皮瓣術后血供的監測以及化療藥物病灶內濃度的評估等。但是,目前由于技術原因所限,實驗室級拉曼光譜儀尚不能直接用于腫瘤組織活體原位檢測,而配備了光纖探頭的便攜式拉曼光譜儀用于臨床原位檢測尚不能達到滿意的信號強度。相信隨著技術的不斷改進,拉曼光譜技術終將會在頭頸腫瘤外科領域表現出巨大潛力,擁有廣泛的應用前景。

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