苦瓜籽蛋白的PEG/(NH4)2SO4雙水相分離及抑菌作用的研究

蔡 馬，于 群，朱新產*

1仲愷農業工程學院生命科學學院，廣州510225;2青島農業大學生命科學學院，青島266109

苦瓜(Momordica charantia L.)已有數百年食用和藥用歷史［1］。臨床實驗研究表明苦瓜中存在多種有效藥用活性成分。從苦瓜籽中分離出的MAP30是堿性糖蛋白質，具有RNA N-糖苷酶活力的生物毒性，也破壞DNA拓撲結構活性，特異地作用于病毒DNA影響其復制表達，既可以作為研究核糖體RNA結構與功能的工具酶，又能將MAP30與單抗耦聯后形成“免疫毒素”［2］?？喙现写嬖陬愐葝u素樣肽，給正常沙鼠、猴及糖尿病患者注射有降低血糖作用，口服同樣有效［3］。用一種非完全純苦瓜蛋白注射到小鼠體內，發現抗體標記的部分癌細胞被殺傷，同時還具有抗白血病和抗病毒的作用［4］?？喙纤匾种仆镁W織紅細胞裂解液中蛋白質合成的活性等［5］。此外，苦瓜還有較強的抗氧化作用［6］?？喙咸崛∥?MCE)更具廣譜的殺菌作用［7］，苦瓜籽粗蛋白對部分植物病原細菌有抑菌活性?？喙系牟煌钚猿煞謱χ虏〖毦椭参锊≡毦囊志饔糜羞x擇性，但其活性成分的分離成為苦瓜開發和利用的瓶頸。大多苦瓜抑菌的研究均集中在葉、果汁上，對苦瓜籽蛋白的研究較少，故此研究苦瓜籽蛋白的有效分離技術及抗菌活性，試圖探究苦瓜籽蛋白獨特的藥理性作用及其分子作用機制，開創苦瓜自然有效資源及其在醫學和天然產物化學研究中應用的新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 苦瓜品種

油苦瓜籽粒，由壽光試驗基地提供。將苦瓜籽外殼剝去后，研磨成粉末，用乙醚浸泡脫脂，風干冷藏備用。

1.1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌(salmonella)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、紅酵母(Rhodotorula sp)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)，均由青島農業大學微生物實驗室提供。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基(細菌)、麥芽汁培養基(酵母菌)、馬鈴薯培養基(霉菌)。

1.2 試驗方法

1.2.1 建立雙水相萃取體系

分別固定PEG6000和(NH4)2SO4質量分數，pH值為 7.0，不添加無機鹽，以不同質量分數的(NH4)2SO4和PEG6000組成雙水相體系［8，9］，取3 g脫脂苦瓜籽粉溶于雙水相之中，4℃攪拌萃取4 h，測定蛋白質的分配系數、相比及萃取率。相關計算公式為:分配系數K=Ct/Cb;相比R=Vt/Vb;回收率(Y%)Yt=上相總酶活/上下相總酶活=CtVt/ (CtVt+CbVb);Yb=下相總酶活/上下相總酶活= CbVb/(CtVt+CbVb);式中:Ct、Cb:分別代表上、下相酶活力;Vt、Vb:分別代表上、下相體積。

1.2.2 苦瓜籽蛋白的分離

采用確定的雙水相體系萃取苦瓜蛋白，經離心、透析，用PEG6000包埋濃縮，冷凍備用。

1.2.3 苦瓜籽蛋白

SDS-PAGE參照文獻［10］的方法，用SDS緩沖液(0.22 M Tris-HCl pH6.8，3%SDS，10%甘油)按1∶1稀釋苦瓜粗蛋白樣品，沸水浴提取3 min，10000 rpm離心 10 min，上清液用于電泳分析。分離膠12.5%，濃縮膠2.5%，在室溫恒流25 mA條件下，電泳約6 h。標準蛋白Marker為MBI SM0431。

1.2.4 凝膠染色顯帶

用0.12%CBB R250，乙醇-乙酸(25%～8%)溶液對SDS-PAGE膠片染色8～10 h，乙醇-乙酸(20%～7%)溶液脫色至背景清晰，透射光下成像相記錄。以標準蛋白的logMW對相對遷移率作標準曲線，依據電泳結果，從標準曲線上求得相對分子量。

1.2.5 苦瓜籽蛋白的抑菌試驗

用無菌吸管吸取0.1 mL菌懸液于無菌平皿中，加入已滅菌的冷卻至45℃的培養基15 mL，混勻后水平放置。因供試菌種的不同，所采用的培養基也不同。用直徑6 mm的瓊脂打孔器均勻打孔，每板6孔，去除孔內瓊脂并適當封閉孔底。將供試苦瓜蛋白液加于孔，每孔15 μL。置4℃冰箱中作用1 h后取出并置于恒溫箱中培養，細菌37℃下培養24 h，真菌27℃下培養48 h。取出后，測定其抑菌圈直徑，取其平均值。

1.2.6 苦瓜籽蛋白最低抑菌濃度(MIC)的測定

參照文獻［11］等的方法，用苯甲酸鈉做對比，濃度為200 mg/mL，并以無菌水做對照，將培養后的培養物與空白對照比色測定，若二者OD值完全相同，即培養基中完全沒有菌生長的最低濃度作為苦瓜蛋白的最低抑菌濃度。

1.2.7 苦瓜籽蛋白的穩定性試驗

采用大腸桿菌試驗菌種，測定不同鹽離子濃度、溫度、pH、紫外線殺菌及低溫冷藏時間等因素對苦瓜蛋白抑菌功能的影響。(1)無機鹽NaCl濃度為: 0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%和6.4%，浸泡純化苦瓜蛋白2 h;(2)溫度設置為:4、24、44、64、84、104℃和124℃，分別處理10 min;(3)pH為:3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0;(4)紫外光下照射時間為:5，10，15，20 min和25 min;(5)低溫(–20℃)儲藏時間:5、10、15、20、25、30、35 d和40 d;調節濃度5 mg/mL，分別測定抑菌效果。

1.2.8 苦瓜籽蛋白的抗氧化作用

清除羥自由基能力測定，參考文獻［12］，·OH清除率(%)=(A1–Ax)/A1×100%，A1——空白對照液的吸光度;Ax——加入純化苦瓜蛋白后的吸光度。

1.2.9 數據分析

用 Quantity One/BandScan5.0軟件對 SDSPAGE凝膠中的每一條帶進行標記、掃描分析。

2 結果與分析

2.1 (NH4)2SO4質量分數對分配系數和回收率的影響

表1 (NH4)2SO4質量分數對苦瓜籽蛋白萃取的影響Table 1 Mass fraction of ammonium sulfate to suffer the effects of Momordia seeds protein extraction

從表1可以看出，當 PEG6000的量固定時，在(NH4)2SO4質量分數較低的范圍內，隨著(NH4)2SO4質量分數的增加，蛋白質的分配系數Kp下降，回收率Yp%在逐漸上升。當(NH4)2SO4濃度超過一定范圍(26.0%)時，Kp又逐漸上升，Yp%逐漸下降?？傮w趨勢中，相比R在下降。綜合考慮，確定(NH4)2SO4的的最佳質量分數為25.0%。

2.2 PEG6000質量分數對分配系數和回收率的影響

表2 PEG6000質量分數對苦瓜籽蛋白萃取的影響Table 2 Mass fraction of polyethylene glycol to suffer the effects of Momordia seeds protein extraction

表2表明，隨著PEG6000質量分數的增加，Kp先下降后上升，Yp先增大后減小，并且在PEG6000質量分數為22.0%時，Kp和Yp都達到最佳值?？傮w趨勢下，R值隨PEG6000質量分數的增加而增大，即下相體積越來越小，上相體積越來越多。蛋白質的分配系數變化較大，而回收率變化較小。因此確定PEG6000質量最佳分數為22.0%。

2.3 雙水相分離苦瓜籽蛋白的SDS-PAGE鑒定分析

雙水相分離的苦瓜籽蛋白，經SDS-PAGE電泳(圖1，表3)，在非還原條件下(–Mer)，出現了22條蛋白帶，其主要蛋白質組分分子量較高，大于35 kD。而在還原條件下(+Mer)，顯示了12條蛋白帶，其主要蛋白質組分在低分子量區，小于35 kD。表明苦瓜籽蛋白中存在較多二硫鍵。

表3 雙水相分離苦瓜籽粒蛋白的SDS-PAGE掃描分析參數Table 3 Scanning parameters of the SDS-PAGE of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

28 442 6.07 4041 1.1 29 456 6.77 9977 3.3 30 471 6.29 6473 1.1 465 6.98 6643 8.6 469 7.00 6014 13.6 31 507 7.44 11048 24.9 32 529 6.62 6711 3.8 33 534 7.58 12766 21.3

2.4 雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌性試驗

體外抑菌試驗顯示雙水相分離的苦瓜籽蛋白(P)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、紅酵母、黃曲霉和黑曲霉產生明顯的抑菌圈(圖2)，表明雙水相分離的苦瓜籽蛋白對細菌和真菌均具有很強的抑制作用，是一種廣譜抗菌蛋白。

圖2 雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌活性Fig.2 The antimicrobial activities of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

2.5 雙水相分離苦瓜籽蛋白的穩定性

通過大腸桿菌抑菌試驗，檢測不同鹽離子濃度、溫度、pH及紫外線等因素條件對雙水相分離苦瓜籽蛋白(5 mg/mL)抑菌活性的影響，顯示雙水相分離苦瓜籽蛋白具有較好的穩定性。

2.5.1 無機鹽對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖3顯示，在NaCL濃度低于0.8%時，鹽離子對雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌活性沒有影響。當NaCL濃度大于0.8 mg/mL時，隨著鹽離子質量濃度的增大，抑菌活性有下降的趨勢，抑菌圈直徑變小。在鹽離子濃度較低時其抑菌活性較強，說明純化苦瓜蛋白在低鹽食品中的抑菌效果較好。

圖3 無機鹽對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.3 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase in NaCl of different concentration

2.5.2 溫度對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖4顯示，當溫度低于44℃時對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性沒有影響。當溫度上升至64℃時，雙水相分離苦瓜籽蛋白經不同溫度處理后抑菌活性有所變化;當溫度為4～44℃時，其抑菌活性基本保持不變，但當溫度升高至64℃，抑菌圈直徑變小，抑菌活性呈下降趨勢;到84℃和104℃時，抑菌活性分別下降56%和82%;124℃時則完全失活。高溫可能使苦瓜蛋白變性，喪失抑菌活性。

圖4 溫度對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.4 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase at different temperature

2.5.3 pH對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖5顯示，隨著pH的升高，雙水相分離苦瓜籽蛋白對菌體的抑制能力有下降的趨勢。在酸性條件下(pH＜7)，雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌活性增強，其抑菌圈直徑增大;堿性條件下(pH＞7)，純化苦瓜蛋白抑菌活性轉弱，抑菌圈直徑減小。在pH6～7之間，緩沖液對雙水相分離苦瓜籽蛋白的抑菌活性沒有影響，并且其抑菌效果較好。

圖5 pH對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.5 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase at different pH

2.5.4 紫外光對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖6顯示，隨著紫外光對雙水相分離苦瓜籽蛋白處理時間的延長，其抑菌活性基本保持不變，抑菌圈直徑沒有明顯變化。提示雙水相分離苦瓜籽蛋白對紫外光具有較高的穩定性。

圖6 紫外光對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.6 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase on ultraviolet

2.5.5 低溫儲藏對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響

圖7顯示，雙水相分離苦瓜籽蛋白在低溫下抑菌活性相對穩定，在15 d內抑菌活性沒有明顯變化;15 d后其活性呈下降趨勢，但仍具有相當的抑菌活性。

圖7 低溫儲藏時間對雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性的影響Fig.7 Influence on antimicrobial activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase in refriqerant time

2.6 雙水相分離苦瓜籽蛋白的最低抑菌濃度(MIC)

比濁法測定雙水相分離苦瓜籽蛋白的最低抑菌濃度結果顯示(表4):雙水相分離苦瓜籽蛋白對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC低于0.2 mg/mL;對酵母菌的MIC低于0.4 mg/mL，對黃曲霉的MIC低于1.6 mg/mL。

2.7 雙水相分離苦瓜籽蛋白的清除羥自由基能力

圖8顯示，雙水相分離苦瓜籽蛋白的清除羥自由基能力。隨著樣品質量濃度的升高，雙水相分離苦瓜籽蛋白的抗氧化能力呈現逐漸增強趨勢，其作用能力低于相同濃度下的抗壞血酸。

表4 雙水相分離苦瓜籽蛋白的最低抑菌濃度Table 4 The MIC value of extract protein by aqueous two-phase from Momordia seeds

圖8 雙水相分離的苦瓜籽蛋白對·OH自由基的清除率Fig.8 Clearance on·OH free radical activities of Momordia seeds proteins extracted by aqueous two-phase

3 討論

當體系中只有PEG沒有(NH4)2SO4時，體系不形成雙水相;當鹽濃度增加到一定量后雙水相形成。蛋白質分配系數小于1，表明蛋白主要分配在下相［13］。(NH4)2SO4用量不同，上下相電位差不同，而電位差的大小直接影響到分配系數和萃取率，而且硫酸銨的質量分數愈高，會破壞酶表面的水化層，則使蛋白發生鹽析，使蛋白的萃取率下降。另外，鹽濃度過高不僅影響蛋白質的表面疏水性，而且擾亂雙水相系統，改變各相中成相物質的組成和相體積比［14］。依據分配理論，隨著聚乙二醇增加，黏度增大，阻止相間分子轉移的能力增加，相界面張力亦增加。當PEG用量較低時，(NH4)2SO4的鹽析作用起主要作用，使蛋白質主要分布在下相中。增大PEG含量，相比增加，上下相熱力學特征差異更大，不同物質分配系數之間的差別也會增大［15］。本試驗表明分離苦瓜籽蛋白的雙水相系統中 PEG和(NH4)2SO4的質量分數、pH、鹽離子濃度等均不相同，其最適的(NH4)2SO4質量分數是25%，最適的PEG6000質量分數是22%，分配系數K＜0.1，蛋白回收率Y%大于95%，由于大多數的蛋白質為中性蛋白，因此調節pH在6.95～7.05之間。

蛋白質的氨基酸組成、序列、立體構象及生物學功能與其它生物分子混合物的理化性質存在著較大差異，從而使得從成千上萬種復雜混合物中分離出蛋白成為可能。本試驗利用雙水相技術，針對苦瓜籽蛋白設計合理特異的分離策略，分離出苦瓜籽蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳顯示(圖1)，苦瓜籽蛋白質主要是50 KD、43 KD和10 KD亞基結合形成的多聚體12S(327 KD)球蛋白，還原條件下出現諸多小于35 kD的蛋白組分。表明蛋白質亞基是通過二硫鍵結合。

植物粗提物對霉菌和酵母菌一般沒有抑制作用，將粗提物提純后所得的較純物質可能對其具有一定的抑制作用［7，16］。本試驗發現雙水相分離出的苦瓜籽蛋白，對受試細菌菌和真菌產生明顯的抑菌活性(圖2)，其MIC遠低于苯甲酸鈉，苯甲酸鈉對細菌的MIC遠高于苦瓜蛋白，約大于1000 mg/mL，但其對霉菌和真菌的MIC為250 mg/mL［17］。提示雙水相分離的苦瓜籽蛋白是一種廣譜型高活性抗菌蛋白。

苦瓜對革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性桿菌具有良好的抑殺菌效果［18］，而且苦瓜原液和苦瓜提取液能有效地延遲肉類食品的腐敗變質和降低其細菌總數。此外，苦瓜還有良好的抗氧化作用，除維生素C、E，苦瓜皂苷也具有抗氧化作用［6］。本試驗表明，雙水相分離的苦瓜籽蛋白具有較強的清除羥自由基能力和總抗氧化能力(圖8)，僅略低于相同濃度下的抗壞血酸。提示雙水相分離的苦瓜籽蛋白是一種抗氧化性較強的蛋白，其顯著的廣譜抗菌活性和抗氧化能力，為化學組成固定、生物反應明確及無安全性顧慮的苦瓜功能產品的開發奠定了科學基礎。

雙水相分離的苦瓜籽蛋白對供試細菌、真菌均有較強的抑制作用，而且在不同鹽離子濃度、溫度、pH及紫外線等因素處理時，均具有一定的穩定性(圖3～7)。但雙水相分離苦瓜籽蛋白熱穩定性較差，64℃以后隨著溫度的上升抑菌活性呈加速下降趨勢，124℃則完全失活。然而，苦瓜葉原液加熱后抑菌活性基本沒有變化［19］，推測原因可能是苦瓜葉中的抑菌成分對熱不敏感，可能含有一些非蛋白類成分;隨著pH的升高，雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性有下降趨勢，pH為3、5時其對供試菌的抑制作用強于對照(pH7.0)，可能因為酸性較強的緩沖液對實驗菌有微弱的抑制作用，或與其性質有關;低鹽離子濃度較時抑菌活性較強，大于0.8 mg/mL濃度的無機鹽影響雙水相分離苦瓜籽蛋白抑菌活性，可能是因為產生了鹽析現象而導致少量蛋白失活，或者鹽的滲透壓升高而受影響;雙水相分離苦瓜籽蛋白對低溫儲藏時間及紫外線照射不敏感，低溫下不易失活，且具有光穩定性。因此，雙水相分離的苦瓜籽蛋白作為一種天然防腐劑及食品添加劑具有良好的加工性能。

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