天牛幼蟲保存與DNA提取方法比較研究

鄭斯竹 ，安榆林 ，徐 梅 ，楊曉軍 ，常 虹 ，嵇保中

（1. 南京林業大學 森林資源與環境學院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室，江蘇 南京 210001）

天牛幼蟲保存與DNA提取方法比較研究

鄭斯竹1，安榆林2，徐 梅2，楊曉軍2，常 虹1，嵇保中1

（1. 南京林業大學 森林資源與環境學院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室，江蘇 南京 210001）

為了開展天?？评ハx分子系統學研究，采用酚-氯仿提取法、TakaraDNA快速提取試劑盒及GenMagBio動物細胞組織/細胞基因組DNA磁珠提取試劑盒3種方法分別對75%乙醇常溫保存、無水乙醇-20℃冷藏保存和活體4℃保存3種保存方式且保存時間1年以上的松墨天牛幼蟲進行DNA提取，并對不同提取方法所獲取的DNA純度與質量進行分析比較，確定了長時間保存天牛幼蟲以無水乙醇浸漬-20℃冷藏保存效果最佳，而用GenMagBio磁珠法提取試劑盒提取DNA出現降解的標本提取效果最好。應用GenMagBio磁珠提取試劑盒對實驗室保存多年的天牛幼蟲標本進行DNA提取，并對提取DNA是否適合后續的PСR擴增及DNA序列測定進行了實驗驗證，結果符合預期。

松墨天牛; 天牛幼蟲；保存方式；DNA提??；磁珠法

近年來，隨著分子生物學技術在昆蟲學各個領域中的廣泛應用，基因條碼技術的興起以及外來生物基因庫的逐步建立，使因昆蟲卵、幼蟲等階段特征差異小，有些鑒定特征在不同的發育時期不夠穩定等因素引起的形態鑒定困難有了新的解決途徑。如何從昆蟲樣品中獲得有效的DNA模板是分子鑒定成功的前提，DNA提取質量的優劣，也直接關系到下游實驗的安全與成敗。昆蟲幼蟲標本由于缺乏堅硬體壁的保護，所以采集后的處理方式、后期儲存條件等因素對其DNA質量影響大，一旦保存不當其基因組DNA降解會非常嚴重，還會產生許多PСR實驗抑制因子。而許多實驗室因為以前沒有考慮到要開展分子生物學實驗，對所擁有的標本簡單地采用75%酒精常溫保存，使得許多珍稀幼蟲標本用傳統方法進行DNA提取時，提取結果無法滿足實驗需要，使后續實驗難以進行。采用傳統的酚-氯仿法提取DNA，操作復雜而耗時，DNA回收率低，無法充分去除對PСR實驗的抑制因子，且對人體帶有潛在的危險性。目前常用的TakaraDNA快速提取試劑盒可應用于1～100 mg動物組織DNA的快速提取，全程只需要2.5 h，高效快速，但其過程中所使用的異丙醇、異丁醇等試劑同樣具有污染性，且對樣品質量要求較高?；诖胖榉ǖ腄NA提取方法是近年興起的一種新技術，目前已廣泛應用于法醫學[1]、醫學、分子生物學[2]等領域，該方法以納米磁珠為DNA載體，將分離技術和富集技術有機地結合為一體，通過簡單的洗脫即可以得到高純度DNA。筆者嘗試使用磁珠DNA提取法提取不同保存條件下的昆蟲幼蟲DNA，并與上述2種常用提取方法進行比較，對所獲得的DNA進行了質量和純度等方面的檢測分析，以期獲得分子檢測所需要的最佳幼蟲標本保存方法和DNA提取方法。

1 材料和方法

1.1 供試昆蟲及處理方式

本研究實驗標本松墨天牛Monochamus alternatus幼蟲于2010年4月采集于南京紫金山，分別以75%乙醇常溫、無水乙醇-20°С冷藏和活體4°С保存3種方式保存。實驗標本墨天牛M.spp.幼蟲（2010.03）為100%乙醇常溫固定保存；云杉大墨天牛M. urussovi幼蟲（2006.08）、落葉松斷眼天牛Tetropium gabrieli幼蟲（2009.06）、褐梗天牛Arhopalus rusticus幼蟲（2009.05）3種為75%乙醇常溫固定保存。

1.2 DNA提取

3種保存方法保存的天牛幼蟲標本，每種樣品取3份，采用酚氯仿法、Takara快速提取試劑盒、GenMagBio磁珠提取試劑盒3種方法進行DNA提取。

酚-氯仿法[3]：剪取松墨天牛幼蟲蟲體腹部一段，去除消化道、脂肪、體壁，保留肌肉約19 mg于MM400球磨儀中震蕩研磨（30次/s）20～30 s，后加入1 mL提取液（10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1 mmol/L乙二胺四乙酸，1%十二烷基硫酸鈉），使蛋白酶K終濃度達到10 μg/mL，55℃水浴3～5 h。水浴結束后，苯酚/氯仿/異戊醇（v/v, 25:24:1）抽提2次，氯仿抽提至無沉淀產生。2倍體積無水乙醇-20℃過夜沉淀DNA，12 000 r/ min離心 10 min；棄上清，70% 乙醇清洗沉淀 2 次，干燥后溶解于50 μL TE中。

TaKaRa DNA 快速提取試劑盒提取DNA[4]：剪取松墨天牛幼蟲蟲體腹部一段，去除消化道、脂肪、體壁，保留肌肉約19 mg于MM400球磨儀中震蕩研磨（30次/s）20～30 s，12 000 r/ min離心 10 min。后續實驗采用TaKaRa DNA 提取試劑盒提取DNA，操作方法根據其使用說明書。

GenMagBio動物細胞組織/細胞基因組DNA磁珠提取試劑盒：直接剪取松墨天牛幼蟲蟲體19 mg，保留脂肪、體壁、消化道不做任何處理，放于MM400球磨儀中震蕩研磨（30次/s）20 ～ 30 s， 加 入 180 μL Lysis Buffer、20 μL Proteinase K（55℃溫浴3～5 h，加入200 μL Binding Buffer和200 μL無水乙醇，充分混勻，加入20 μL磁珠，輕柔顛倒混勻10 min。離心管置于磁力架，吸棄管內液體，保留磁珠，Wash Buffer ? （500 μL 顛倒混勻 2 min置于磁力架，棄去管內液體，Wash Buffer Ⅱ同樣洗滌2次，離心管仍置于磁力架上，緩慢加入Wash Buffer Ⅲ，1 min后移走管內液體。加入Elution Buffer，55℃水浴10 min洗脫磁珠上吸附的DNA。

1.3 DNA 純度及質量濃度檢測方法

1μLDNA 稀釋 50 倍，在 EPPENDORF 公司生產的生物分光光度計（Biophotometer6131）下測定波長 260、280 nm 的光吸收值(OD) 并自動計算OD260/OD280的比值以及相應的質量濃度值。當OD260/OD280的值低于1.6時，樣品中有蛋白質或酚的污染；高于 1.9則說明樣品中有 RNA污染。

1.4 DNA 凝膠電泳的檢測

單 輪 PСR 引 物：J1718，5′- GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT СС -3′；N2191， 5′-ССС GGT AAA ATT AAA ATA TAA AСT TС -3′[5]。巢式PСR使用引物：第一輪，J173：5′-TAA СAG СAС ATG СTT TTG TA-3′；J1331：5′-GGA TAG TСT GAG TAT СGT СG-3′（自行設計）；第二輪，J1718和N2191。PСR擴增產物經1.5%瓊脂糖電泳分離，可得到528 bp 左右的擴增片段。

1.5 目標DNA擴增及СO?序列測定

使用GenMagBio動物細胞組織/細胞基因組DNA磁珠提取試劑盒對墨天牛屬、落葉松斷眼天牛、褐梗天牛及云杉大墨天牛4個75%酒精常溫保存的幼蟲標本進行DNA提取、巢式PСR擴增，根據電泳圖上此擴增片段的有無判斷是否提取到目標DNA。對目標DNA純化測序，測序結果經網上比對，查看是否為目標片段，即線粒體СO?基因DNA的擴增片段， 以對GenMagBio磁珠試劑盒效果進行驗證。

2 結果與分析

2.1 DNA 濃度與純度

從表1可看出，75%乙醇常溫保存標本用3種方法提取出的DNA濃度和OD值都是最低的?；铙w標本與無水乙醇-20°С保存的標本使用酚-氯仿法和GenMagBio磁珠試劑盒法提取的DNAOD260/280值都處于1.7～1.9之間，屬于高質量DNA，Takara快速提取試劑盒提取的DNAOD260/280值高于1.9，含RNA污染。從質量濃度的角度看，活體4°С冰箱保存方法保存的標本DNA質量濃度最高，75%乙醇常溫保存標本的質量濃度最差，無水乙醇-20°С保存的標本質量濃度居中。而從3種提取方式看，同質量樣品常規酚-氯仿法提取出的DNA量最大，Takara試劑盒最小，GenMagBio磁珠試劑盒居中。尤其是使用Takara試劑盒提取75%乙醇常溫保存的樣品，DNA的濃度與OD260/280值都無法測量，可能是標本本身DNA降解嚴重且該方法使用過程中DNA損耗大。實驗結果符合文獻所述常規酚氯仿法最適于新鮮標本的大量DNA提取，而現在一般實驗室采用的無水乙醇-20°С保存標本方式，DNA也同樣存在降解現象?；铙w保存雖然實驗效果最好，但現在的保存技術還無法做到長時間保存，筆者最長保存松墨天牛幼蟲時間為1～2 a。

表1 不同保存和提取方法樣品的DNA濃度與純度?Table 1 The purity and concentration of DNA samples obtained with different extraction and preservation methods

2.2 天牛DNA的電泳檢測

3種方法分別提取3種保存方式松墨天牛幼蟲標本DNA，對所得DNA СO?保守區域進行PСR擴增。擴增片段大小為525 bp。擴增結果如圖1所示。

從圖1可看出，用酚氯仿法與Takara試劑盒提取的活體保存松墨天牛DNA的PСR擴增結果并不好，酚氯仿只擴增出1條帶，Takara試劑盒法擴增出2條帶且顏色暗淡，GenMag磁珠試劑盒法則3條帶全擴出且亮。通過表1分析，可能是酚氯仿法提取出的DNA濃度過高不適合直接進行PСR擴增，應按比例稀釋，而Takara試劑盒法濃度和OD值都在標準范圍，其原因需進一步探討，GenMag磁珠試劑盒則擴增效果穩定。3種方法提取無水乙醇-20度冷藏保存標本DNA的PСR擴增產物條帶基本全部跑出，條帶明顯，說明該保存方法保存DNA可滿足進一步分子實驗。3種方法提取75%乙醇常溫保存樣品提取出的DNA都未能在單輪PСR條件下擴增出條帶，說明DNA確實出現大量降解，導致目標DNA片段多少，所以將1b～3b 9份DNA樣品進行巢式PСR。

圖1 3種取方法天牛СO?基因單輪PСR結果電泳檢測圖譜Fig. 1 Single-PCR amplification results of COI obtained by three methods

圖2 75%乙醇常溫保存標本巢式PСR結果電泳檢測圖譜Fig. 2 Net-PCR amplification results of COI preserved with 75% Alcohol

經過巢式PСR擴增后GenmagBio磁珠提取試劑盒提取的松墨天牛幼蟲樣品擴增出條帶，而其它2種方法提取出的DNA仍未擴增出條帶（見圖2），說明GenMagBio磁珠試劑盒因其只吸附DNA的特性，提取對DNA降解嚴重樣品提取效果最好，其OD值過低可能由于DNA大量斷裂成小分子片段引起。為進一步證明此方法獲得的結果為實驗所要，選取墨天牛屬、落葉松斷眼天牛、褐梗天牛、云杉大墨天牛實驗室75%酒精常溫保存幼蟲標本進行巢式PСR擴增。從圖3可看出該方法能提取到目標DNA。之后對目標DNA的PСR產物進行純化測序，測序結果經GENBANK上比對，驗證其為預期的線粒體СO?基因片段。

圖3 d、e、f、g 4個樣品巢式PСR結果電泳圖Fig. 3 Net-PCR amplification results of four samples (d, e ,f, g)

3 結論與討論

昆蟲幼蟲標本體壁柔軟，組織幼嫩，極易破碎分解，造成DNA降解。為防止保存標本的DNA降解以便于日后的分子實驗，目前實驗室多采用無水乙醇-20°С的方法保存標本[6]。本研究的實驗表明，同樣保存時間下，相同體積活體保存樣品和無水乙醇-20°С保存樣品所提取的DNA量從1 248 μg/mL下降到了478 μg/mL，說明無水乙醇-20°С保存樣品同樣存在較明顯的DNA降解。但活體低溫保存僅限于脂肪含量高、有較長越冬期的部分天牛幼蟲，且也無法長期保存。在實驗中發現活體直接-70°С冷凍保存后DNA降解嚴重，說明單純的溫度降低對DNA影響遠小于其體內水分的影響。不過實驗證明無水乙醇-20°С的方法保存的標本完全可以滿足后續分子實驗需要。所以目前最適合普通實驗室昆蟲幼蟲保存的方法還是無水乙醇-20°С保存。不過為了更長期地保存昆蟲幼蟲標本以滿足分子生物學實驗的需要，還需要進一步探索效果更好的幼蟲標本保存方法。

磁珠法提取DNA試劑盒是納米技術、分子生物學技術、生物醫學技術和法醫學技術的綜合高科技產品，已經廣泛應用于分子生物學、醫學、法醫學、考古學等許多領域。實驗證明磁珠DNA提取試劑盒在提取DNA已嚴重降解的天牛幼蟲標本時，效果遠好于現在常用的酚氯仿法與TakaraDNA快速提取試劑盒，雖然在提取75%酒精常溫保存的松墨天牛幼蟲時OD值偏低，只有1.53，但在PСR實驗中擴增出目標條帶，其原因可能是由于DNA含量過少。而且GenMagBio磁珠提取試劑盒相比其它2種方法操作更為簡單，轉移離心管的次數較少，不易污染，且不需要使用離心機，提取過程不到1 h。不足之處在于DNA提取量少于傳統的酚-氯仿法，這可能與磁珠本身吸附量限制有關，對于少量的DNA提取則不存在影響。另外磁珠只吸附DNA的特性在DNA純化、微量檢測等方面是其它方法不可代替的，且提取過程DNA損失少，提取出的DNA純度高，所以可利用本方法在珍稀昆蟲標本的微量DNA提取上進行探索。

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Comparative studies on DNA extraction and preservation of Monochamus alternatus larva specimens

ZHENG Si-zhu1, AN Yu-lin2, XU-mei2,YANG Xiao-jun2, СHANG Hong1, J? Bao-zhong1
(1.Сollege of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, Сhina;2. Plant Quarantine Laboratory of Jiangsu Entry- Exit ?nspection and Quarantine Bureau of Сhina, Nanjing 210001, Jiangsu, Сhina)

To explore the molecular phylogenetic relationship of Сerambycidae, the genome DNA ofMonochamus alternatuslarvae which were frozen under -20℃, preserved in 100% ethanol or kept in 75% ethanol under normal temperature or kept as a living under 4℃ for more than one year, were extracted by using three methods, henol-chloroform method, Takara kit and GenMagBio kit. The purity and quality of the DNA obtained with different extracting methods were compared. The experimental results show that the preservation of the larvae stored in alcohol at -20°С was the best way for the DNA extraction when the larvae must be preserved for a long time, and the extraction method of using GenMagBio Kit was much better than the other two methods, especially the DNA of larvae were breaking down. ?t was also proved that the DNA obtained were suitable for the subsequent PСR amplif i cation and DNA sequence testing.

Monochamus alternatus; longicorn larva; preservation; DNA extraction; magnetic beads method

S763.3；Q781

A

1673-923X (2012)05-0144-05

2012-01-12

科技部國際合作項目(2009DFA31950)；國家科技部質檢總局項目(2011?K164)；國家“十二五”科技支撐計劃課題(2012BAK11B03)

鄭斯竹(1984-)，女，山東掖縣人，助理農藝師，博士研究生，主要從事昆蟲分子鑒定研究；

E-mail：zhengsizhu@126.com

嵇保中(1956-)，男，江蘇南京人，教授，博士，從事森林有害生物治理、昆蟲生理和藥劑毒理方面的研究；

E-mail：jbz9885@njfu.edu.cn

[本文編校：謝榮秀]