不同地區蕭氏松莖象遺傳多樣性的RAPD分析

李國宏， 王 偉， 趙同海

(中國林業科學研究院 森林生態環境與保護研究所，北京 100091)

不同地區蕭氏松莖象遺傳多樣性的RAPD分析

李國宏， 王 偉， 趙同海

(中國林業科學研究院 森林生態環境與保護研究所，北京 100091)

以蕭氏松莖象7個地理種群的基因組DNA為材料，對其進行隨機擴增多態性DNA(RAPD)分析，從80個引物中篩選出39個穩定性好、多態性高的引物。7個地理種群共擴增出489條擴增條帶，每條引物平均可以得到12.5條擴增條帶，其長度從250～2 000 bp不等，其中443條(90.6%)擴增條帶為多態性條帶，平均每條引物可得到11.4條多態性條帶。通過公式計算多態性位點、遺傳距離、及Nei’s遺傳距離，結果表明:蕭氏松莖7個地理種群之間的遺傳距離指數的變異范圍為0.403 7～0.484 4，遺傳相似性指數為0.515 6～0.596 3，平均遺傳距離指數為0.444 1；其Shannon’s信息指數為0.588 6～0.625 7，Nei’s遺傳距離為0.009 0～0.030 2；表明蕭氏松莖象種群間存在一定的遺傳多樣性。通過UPGMA聚類分析，將7個蕭氏松莖象地理種群劃分為4個聚類簇。分析表明，蕭氏松莖象7個地理種群存在豐富的遺傳多樣性，其遺傳分化與地理位置有一定的相關性。

蕭氏松莖象；地理種群；遺傳差異；隨機擴增多態性DNA

蕭氏松莖象Hylobitelus xiaoiZhang屬鞘翅目Coleptera象蟲科Сurculionidae，是1988年發現的一種新的松樹蛀干害蟲[1]。主要寄主為濕地松、火炬松，馬尾松、華山松和黃山松。對蕭氏松莖象危險性的綜合評價結果表明:蕭氏松莖象在我國屬于接近高度危險的森林有害生物[2]。該蟲在我國的發生歷史不算很長,但其危害呈迅速蔓延之勢[3]，而且還有進一步擴散可能，目前主要集中在江西、貴州、湖南、湖北、廣西、廣東、福建7省，給我國南方的松林資源構成較大的潛在威脅，也嚴重威脅到了這些森林的健康[4]。

隨機擴增多態DNA(Random Amplif i ed Polymorphic DNA ,簡稱 RAPD) 技術是 Williams 和Welsh 研究小組于1990 年同時提出的一項DNA 多態檢測新技術,是一項建立在PСR 基礎上的DNA指紋技術[5]。該技術使用一系列的隨機引物可檢測到覆蓋整個基因組范圍的遺傳改變,而無需先了解被測基因組相關分子生物學信息。作為一項新興技術,RAPD 也被引入到昆蟲學的研究領域中，廣泛應用于昆蟲遺傳多樣性的研究。國內外利用RAPD技術研究昆蟲遺傳變異、分類進化的報道，已涉及鱗翅目、同翅目、雙翅目、直翅目、鞘翅目等許多目、科[6-14]，但對蕭氏松莖象的RAPD研究國內外尚未見報道，本文應用RAPD技術對蕭氏松莖象7個地理種群進行了研究，以期初步了解不同地域蕭氏松莖象種群的遺傳結構信息，為今后進一步研究環境或農藥等因素對蕭氏松莖象遺傳結構的影響以及對蕭氏松莖象的綜合治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料的分布

2007年7月至2008年8月期間，在我國福建寧化、廣東英德、廣西臨桂、貴州都勻、江西永修、湖南東安和湖北荊門七地區進行了蕭氏松莖象幼蟲標本的調查收集，采集的幼蟲用無水乙醇保存(見表1)。

表1 用于DNA抽提和RAPD分析的蕭氏松莖象標本及其采集地信息Table 1 Distribution, locality , altitude and hosts of 7 populations of H. xiaoi

1.1.2 引物

使用80個10 bp的隨機引物(北京賽百盛基因技術有限公司生產)對蕭氏松莖象總DNA進行PСR擴增以檢測其有效性。其中39條引物可以產生可重復的清晰的多態電泳條帶，因而被選擇來作為進一步分析的引物(見表2)。

1.2 方 法

1.2.1 蕭氏松莖象總DNA提取和檢測

每種樣品選取蕭氏松莖象幼蟲10只，使用T?ANGEN 生產的 T?ANamp Genomic DNA Kit動物細胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒分別提取總DNA，并使用Thermo 公司 NanoDrop 1000分光光度計檢測總DNA的純度和濃度，然后將10份DNA進行混合使各樣品終濃度相同。以此DNA樣品進行RAPD分析。

1.2.2 RAPD-PСR反應體系和條件

通過對DNA稀釋倍數、dNTP濃度、Taq酶量、退火溫度等的優化，最終選定PСR擴增體系為：10×Buffer 5 μL，總 DNA 模板 180 ng，dNTP Mix(10 mmol) 1 μL；RAPD 引 物 (10 μmol)各 1 μL；Taq酶 (2.5 U/μL)0.4 μL，加 ddH20 至總體積為 50 μL。PСR擴增條件為：94 ℃ 預變性5 min；變性94 ℃30 s，退火 37 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 2 min；45 個循環后，72 ℃延伸15 min。反應在Effendorf公司生產 的 PСR 儀 (Biometra Tgradient Thermocycler)上進行。

擴增產物用含EB(0.5 μg/mL)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察并拍照。

1.3 數據處理和分析

擴增的DNA片段出現頻率小于0.99的條帶為多態性條帶。多態性條帶比率=多態性條帶數/檢測到的總擴增條帶數。將電泳圖譜上清晰且可重復出現的條帶賦值為“1”，同一位置無帶的賦值為“0”，由此形成二元數據。統計各條引物的擴增條帶數和多態性條帶數，所得數據使用S?MQUAL(Similarity for Qualitative Data)法 進 行Dice相似系數的分析，其相似性系數應用NTSYS-pc2.10軟件進行UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)聚類分析[15]，并計算各樣品間的遺傳距離，繪制樣品間的親緣關系聚類樹形圖。同時使用POPGEN32軟件[16]統計擴增產物的條帶總數和多態帶數量，計算Neil’s基因多樣性(H)和Shannon信息多樣性指數(?)。根據基因頻率矩陣，利用POPGEN32軟件計算總體遺傳多樣性(Ht)、種群平均遺傳多樣性(Hs)、基因分化系數(Gst)和基因流(Nm)。

2 結果與分析

2.1 蕭氏松莖象總DNA的純度和濃度

所有樣品DNA的OD260/OD280均為1.8～2.0之間。適合進一步的RAPD-PСR的要求，所提取的DNA濃度為186～357 ng/μL。

2.2 RAPD圖譜和多態性

使用39條隨機引物對7個地理種群進行擴增分析，共獲得489條擴增條帶，每條引物平均可以得到12.5條擴增條帶，其中443條擴增條帶為多態性條帶，其所占比例從42.9%(F2)到最高的 100%(A1、A8、B2、B5、С1、С7、D1、D6、E8、F9、G10、H2、H4、H9)，總計達到 90.6%(見表2)。其長度從250 bp到2 000 bp不等，主要分布在400 bp到1 500 bp之間。每條引物擴增出的條帶數在5條(G5)到19條(A1)之間。每個地理種群均含有特異的擴增產物以區別于其他地理種群。實驗結果表明，蕭氏松莖象的遺傳背景比較復雜，有較高的遺傳多樣性，引物F2擴增的結果就是典型的例子(見圖1)。

圖1 引物F2擴增產物電泳圖像Fig. 1 Result of PCR amplification by using primer F2

表2 RAPD中39個隨機引物的擴增效果Table 2 Sequences and amplifications of 39 random primers

2.3 不同地理種群間的遺傳距離和遺傳相似指數及聚類分析

用NTSYS-pc2.10得到蕭氏松莖象7個地理種群Dice相似系數，計算它們之間的遺傳距離，其變化范圍為0.403 7～0.484 4，平均值為0.444 1。其中福建寧化種群和江西永修種群之間的遺傳距離最大(0.484 4)，遺傳距離最小的是廣西臨桂種群和貴州都勻種群(0.403 7)。7個地理種群間的遺傳相似度范圍為0.515 6～0.596 3(見表3)，廣西臨桂種群和貴州都勻種群相似性最高(0.596 3)，福建寧化種群和廣東英德種群其次(0.595 7)，江西永修種群和廣西臨桂種群最低(0.515 6)，這與Nei’s遺傳距離是一致的。

表3 蕭氏松莖象不同地理種群間遺傳距離指數和遺傳相似系數?Table 3 Genetic distance and genetic identities between populations

根據遺傳距離的大小，應用UPGMA建樹方法對蕭氏松莖象7個種群以及所有個體進行聚類分析，種群間聚類圖(圖2)與個體間聚類圖(圖3)相符。由圖2、3可知，個體間均以地理種群進行類聚， 7個地理種群在相似性系數為0.570 0時分成4支，福建寧化種群、廣東英德種群和湖北荊門種群為一支，廣西臨桂種群和貴州都勻種群為一支，湖南東安種群和江西永修種群分別為單獨的一支。

圖2 蕭氏松莖象7個地理種群間的UPGMA聚類Fig. 2 UPGMA dendrogram of 7 populations of H.xiaoi

圖3 蕭氏松莖象35個個體的UPGMA聚類樹Fig. 3 UPGMA dendrogram of 35 individuals of H.xiaoi

2.4 蕭氏松莖象的遺傳多樣性

由Shannon’s信息指數(表4)顯示，7個地理種群的平均多樣性在0.588 6到0.625 7之間變化，平均遺傳多樣性由高到低的順序為:江西永修種群為0.588 6、湖南東安種群為0.590 1、湖北荊門種群為0.594 3、福建寧化種群為0.595 3、貴州都勻種群為0.598 9、廣西臨桂種群為0.604 4、廣東英德種群為0.625 7。

用POPGENE軟件在假設遺傳平衡時，由Shannon’s信息指數估算的種群間遺傳分化數據(見表5)顯示，總體遺傳多樣性(Ht)為0.420 4，種群平均遺傳多樣性(Hs)為0.411 9，種群內平均遺傳多樣性(Hs)占總體遺傳多樣性(Ht)的97.98%。根據總體遺傳多樣性和種群平均遺傳多樣性計算不同種群間的遺傳分化水平，基因分化系數(Gst)為0.020 2，即表明總的遺傳變異中只有2.02%的變異存在在種群間。種群每代遷移數是測定基因流的一種方法，用于反映各種群間及種群內的遺傳分化程度。估算得出基因流(Nm)的平均值為24.313 1，可以認為種群間的基因流很大。

Nei’s遺傳距離數據(表6)顯示，蕭氏松莖象7個地理種群的遺傳距離差異較小，在0.009 0到0.030 2之間，均小于0.05。其中廣西臨桂種群和江西永修種群之間的遺傳距離最大(0.030 2)，廣西臨桂種群和貴州都勻種群之間的遺傳距離最小(0.009 0)，種群遺傳距離與種群地理距離之間無明顯相關性。

表4 各地理種群各引物的Shannon’s信息指數Table 4 Shannon’s index of various primers of geographic populations

表5 由Shannon’s信息指數估算的種群間遺傳分化?Table 5 Genetic differentiation among populations estimated by Shannon’s index

表6 蕭氏松莖象不同地理種群間Nei’s遺傳距離Table 6 Nei’s genetic distance of 7 populations of H.xiaoi

3 討 論

RAPD技術在許多昆蟲種類的研究中已經得到廣泛應用，但在蕭氏松莖象種群的研究中未見報道。本試驗通過篩選出適合的PСR反應體系，使用39條引物，檢測出489條多態性條帶，平均每對引物擴增出12.5條多態性條帶且具有較好的重復性，其多態性豐富，對蕭氏松莖象種群遺傳差異的檢測效率非常高。

蕭氏松莖象是非遷飛性害蟲，成蟲飛翔能力較弱。本試驗結果表明，蕭氏松莖象不同地理種群之間已經產生了一定程度的遺傳分化。從系統聚類圖來看，這種分化或許是和地理位置有一定關系的。在相似性系數為0.570 0時，蕭氏松莖象7個地理種群被分成4個主要的聚類簇。廣西臨桂種群和貴州都勻種群親緣關系最近，福建寧化種群和廣東英德種群其次，廣西臨桂種群和江西永修種群親緣關系最遠。從地理位置來看，江西永修種群較其他種群遺傳距離遠，這可能是由于它的地理隔絕較早故差異較大，此結果也符合蕭氏松莖象最早發生在江西省境內的說法[2-3]。然后，它們傳播到附近各省形成不同的聚類簇。而福建寧化種群和廣東英德種群，廣西臨桂種群和貴州都勻種群，它們間的地理位置均相互靠近為鄰省，在地理位置上極有利于蕭氏松莖象的傳播。

由Shannon’s信息指數顯示:廣東英德種群和廣西臨桂種群的種群遺傳多樣性相對較高；江西永修種群和湖南東安種群遺傳多樣性相對較低。其結果與Dice相似系數的數據分析結果一致。

基于Shannon’s信息指數估算的種群間遺傳分化顯示，蕭氏松莖象種群內的遺傳變異比率(97.98%)遠高于其種群間的遺傳變異比率(2.02%)；根據種群間遺傳分化系數(Gst)計算種群每代遷移數目(Nm)為24.313 1，可防止由遺傳漂變引起的蕭氏松莖象種群間的遺傳分化；Nei’s遺傳距離揭示種群間的遺傳距離較小(均小于0.05)。這幾項數據結果綜合表明，蕭氏松莖象7個地理種群之間有一定的遺傳分化，但種群間遺傳關系很近，種群之間保持著一定水平的基因交流，這可能與樹苗和木材的跨省運輸有關。

綜上所述，蕭氏松莖象7個地理種群間保持著一定程度的基因交流，種群內具有較高的遺傳多樣性，種群間遺傳距離較小。由于地理位置的差異，各種群間有不同程度的遺傳分化，可初步判定其傳播路徑。

[1] 張潤志.蕭氏松莖象——新種論述(鞘翅目: 象蟲科)[J].林業科學, 1997, 33(6): 541-545.

[2] 宋玉雙,王明旭,宋金秀,等. 森林有害生物蕭氏松莖象的危險性分析[J].中國森林病蟲,2001,(3) :3-5.

[3] 羅永松,梅仁蓮.蕭氏松莖象呈迅速蔓延趨勢[J].江西植保,2002,25(1):21-22.

[4] 唐艷龍, 余 林, 溫小遂，等，蕭氏松莖象研究進展[J].江西植保,2009,29(4):163-169.

[5] Williamsj G K,Kubelika R,Livak K J,et al.DNA polymorphisms am2 plif i ed by arbitrary primers are useful as genetic markers [J].Nucleic Acids Research ,1990 ,18(22) :6531 - 6535.

[6] Scataglini M A , Сonfalonieri V A, Lanteri A A. Dispersal of the Сotton Boll Weevil (Сoleoptera: Сurculionidae) in South America: Evidence of RAPD Analysis[J].Genetica ,2000,108(2):127-136.

[7] WFS Martins, СFJ Ayres,WA Lucena.Genetic diversity of Brazilian natural populations of Anthonomus grandis Boheman(Сoleoptera: Сurculionidae), the major cotton pest in the New World[J].Genetics and molecular Research, 2007, 6 (1): 23-32.

[8] Kim KS and Sappington TW. Genetic structuring of boll weevil populations in the US based on RAPD markers[J]. ?nsect Mol.Biology,2004,13: 293-303.

[9] 孟子燁, 陳曉琴, 江世宏,等. RAPD技術在昆蟲分類學研究中的應用[J].重慶師范大學學報,2009,26(2):33-38.

[10] 曹蘭娟, 楊寶山, 李 俊, 等.不同地區栗蠶(Dictyoploca japonica)的RAPD分析[J].蠶業科學, 2007,33(2):293-296．

[11] 曹天文, 張 敏, 張建珍, 等.大紫蛺蝶三個地理種群的RAPD遺傳多樣性分析[J].動物分類學報,2005,30(1):1-9．

[12] 張建珍,張 敏,郭亞平,等. 徐州、平山兩地中華稻蝗和日本稻蝗的群體遺傳關系分析[J].中國農業科學，2005,38(1):70-75．

[13] 代金霞,鄭哲民. RAPD技術在鞘翅目昆蟲中的應用概況[J].寧夏農學院學報,2003,24(1):62-64.

[14] 田英芳,鄭哲民,七種蟋蟀基因組DNA的RAPD多態性研究(直翅目:蟋蟀總科) [J].昆蟲分類學報, 2001, 23(4):248-252.

[15] Nei M. Molecular Evolution Genetics[M]. New York: Сolumbia University Press, 1987.

[16] A joint Project Development by Francis С. Yeh and Rong-cai Yang. POPGENE VERS?ON 1.31. University of Alberta And Tim Boyle, Сenter for ?nternational Forestry Research August.1999. ftp://ftp.microso ft .com/Softlib/MSLF?LES/HPGL.EXE

RAPD analysis on genetic diversity of Hylobitelus xiaoi Zhang from different geographical population in China

L? Guo-hong ,WANG Wei ,ZHAO Tong-hai
(Research ?nstitute of Forest Ecology, Environment and Protection, Сhinese Academy of Forestry, Beijing 100091, Сhina)

The genetic variation of seven geographic populations ofH. xiaoiwere detected by RAPD. A total of 489 bands(from 250 bp to 2 000 bp) were amplif i ed by using 39 primers screened from 80 random primers of which 443 bands (90.6%) were polymorphic,thus the average number of polymorphic bands was 11.4 per primer. The data analysis show that the genetic comparability of the seven geographic populations varied from 0.515 6 to 0.596 3 and the range of genetic distance was from 0.403 7 to 0.484 4, with the average 0.444 1. The Shannon’s information index was from 0.588 6 to 0.625 7 and the Nei’s genetic distance was from 0.009 0 to 0.030 2.The seven geographical populations were classif i ed into four cluster groups by UPGMA method. The studying results revealed that the genetic diversity and homology existed between geographic populations ofH. xiaoi.

Hylobitelus xiaoiZhang; geographic population; genetic diversity; RAPD

S718.7

A

1673-923X (2012)05-0149-06

2011-09-22

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金資助項目(СAFR?FEEP201007)

李國宏(1971-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事林木蛀干害蟲研究；E-mail:lmz9827@yahoo.com.cn

[本文編校：吳 毅]