3個金銀花新品種逆境條件下脯氨酸含量初步分析

蔡 能 ， 王曉明 ,3，曾慧杰 ，李永欣

(1.湖南省林業科學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省林木無性系育種重點實驗室，湖南 長沙 410004；3.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004)

3個金銀花新品種逆境條件下脯氨酸含量初步分析

蔡 能1,2， 王曉明1,2,3，曾慧杰1,2，李永欣1,2

(1.湖南省林業科學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省林木無性系育種重點實驗室，湖南 長沙 410004；3.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004)

通過干旱、低溫、水分脅迫處理，測定了3個金銀花新品種金翠蕾、銀翠蕾、白云的相對含水量、脯氨酸含量等指標，結果表明：干旱脅迫下，脯氨酸含量先升高后降低，金翠蕾含量最高，抗旱性最強，其次是銀翠蕾，白云抗旱性最弱；水淹脅迫下，白云體內脯氨酸含量上升最快，峰值最大，抗澇性最強，金翠蕾和銀翠蕾抗澇性弱于白云，抗澇程度大致一致；冷凍條件下，金翠蕾離體葉片積累更多脯氨酸，抗寒性最強，其次為銀翠蕾，白云抗寒性最弱。

金銀花；脯氨酸；抗旱性；耐澇性；抗寒性

金銀花是一種具保健、藥用、觀賞及生態功能于一體的經濟植物，也是國務院確定的名貴中藥材之一。湖南省林業科學院從灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides中選育出高產、優質的花蕾型金銀花‘金翠蕾’、‘銀翠蕾’和‘白云’3個優良新品種，干花產量比普通種高出130.9%～172.0%，干花綠原酸含量比普通種高出34.64%～60.97%，并具較強的抗病蟲能力和適應性，經濟效益顯著，各地引種興趣高漲。但是，近年來隨著全球氣候環境惡化，干旱、洪澇、霜凍等自然災害天氣發生頻率越來越高，對其抗逆性進行研究變得尤為重要，這將為擴大其栽培種植范圍、研究配套栽培技術提供科學依據。

植物在受到逆境脅迫時會表現出各種不同的性狀，嚴重時將導致死亡，具體表現為其體內一些酶和滲透調節物質的變化。通?？赏ㄟ^測量植物體的細胞膜透性、過氧化物酶(POD) 活性、游離脯氨酸含量等生理指標了解植物體受迫害程度, 從而得知植物體忍受逆境脅迫的最大能力，有助于探討其在不同的生長環境條件下進行配置應用[1]。其中，逆境脅迫下植物體內游離脯氨酸含量及其變化是衡量植物抗逆性的重要指標，因此本研究以干旱、水澇、冰凍條件下3個新品種的脯氨酸含量為分析對象，旨在研究3個金銀花新品種對逆境條件的反應與耐受能力，為其適應性栽培和大面積推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為灰氈毛忍冬新品種‘金翠蕾’、‘銀翠蕾’、‘白云’營養缽苗，苗高大約15 cm，營養缽9 cm×9 cm。試驗時間為5～8月。

1.2 研究方法

1.2.1 脅迫處理方法

（1）干旱處理

在溫室大棚內，采用自然干旱法，先用水澆透土壤，后讓其自然干旱，將干旱處理當天記為第1天，測量脯氨酸含量，以后每2天測量1次。

（2）低溫處理

取當年生新梢葉分別置于0、-10、-20、-30℃低溫冰箱中處理24 h，分別測量脯氨酸含量。

（3）水淹處理

選擇生長一致的植株在大棚水池內進行水淹處理，每個品種5 株，水深與盆內土表高度相齊，將處理當天記為第1天，測量脯氨酸含量，以后每2天測量1次。

1.2.2 離體葉的相對含水量和水分飽和虧缺的測定

參照陳建勛[2]、Lu[3]、侯福林[4]等人的研究方法進行。剪下葉片后立刻稱鮮質量(WF)，然后將它們放在燒杯中，用蒸餾水浸泡24 h，拭去葉片表面水分，稱飽和質量(WSF)，之后于鼓風烘箱中80℃烘干48 h，稱干質量(WD)。3次重復，取平均值，計算該次取樣植物葉片的相對含水量。

相對含水量（RWС，CRWС，%）：

水分飽和虧缺(WSD，WWSD，%)：

1.2.3 離體葉片水分的測定

取各品種相同部位的10片離體鮮葉分別稱鮮質量(MF)，然后在溫度30℃、濕度73%條件下進行風干，每隔1 h測定葉片質量，連續測定，直至葉片質量基本無變化，以此質量作為葉片失水后的質量(MD)。失水率（R,%）公式為：

1.2.4 游離脯氨酸的測定

參照侯福林和李合生的方法[4-5]。脯氨酸標準曲線：在1～10 μg/mL 脯氨酸濃度范圍內制作標準曲線。取標準溶液各2 mL，加入2 mL 3%磺基水楊酸、2 mL 冰乙酸、4 mL 2.5%茚三酮溶液，置沸水浴中顯色60 min，冷卻后，加入4 mL甲苯萃取紅色物質。靜置后，取甲苯相測定520 nm波長處的吸收值（以甲苯為空白對照），依據脯氨酸量和相應吸收值繪制標準曲線。

游離脯氨酸的提取: 稱取約0.3 g葉片鮮樣（來自經冷凍處理），剪碎后放入具塞試管中，加5 mL 3%磺基水楊酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10 min，過濾液待測。

游離脯氨酸的測定: 取提取液2 mL于具塞試管中，加入2 mL蒸餾水、2 mL冰醋酸和3 mL酸性茚三酮試劑，搖勻后在沸水浴中加熱顯色2 h，取出后冷卻至室溫，加入5 mL甲苯，充分搖勻以卒取紅色產物。靜置約10 min，吸取甲苯層，于分光光度計520 nm波長處測定吸光度。

計算樣品中的脯氨酸含量:

式中：C為脯氨酸含量（μg/g）；C0為由標準溶液求得脯氨酸μg數；V為提取液總體積（mL）；A為測定液總體積（mL）；W為樣品質量（g）。

2 結果與分析

2.1 離體葉的相對含水量和水分飽和虧缺

相同條件下，金翠蕾相對含水量最高，達到92.5%，白云相對含水量最低，為80.73%；金翠蕾水分虧缺最小，為7.50%，白云水分虧缺最大，為19.27%；金翠蕾失水率最低，為62.18%，白云失水率最高，為74.11%；銀翠蕾的相對含水量、水分虧缺和失水率均處于兩者之間（見表1）。從這3組數據分析，金翠蕾植株體內含水量較高，對水的需求相對較小，更難失水，因此，金翠蕾抗旱性最強，銀翠蕾次之，白云最弱。

表1 3個品種的相對含水量、水分飽和虧缺和失水率Table 1 RWC,WSD and water loss rate of 3 cultivars

2.2 干旱脅迫下脯氨酸含量變化

金翠蕾、銀翠蕾、白云在干旱脅迫過程中脯氨酸含量變化趨勢大致相同，先揚后抑。干旱脅迫初期，隨著干旱脅迫的加強，脯氨酸含量升高。當干旱脅迫第5天時，脯氨酸含量急劇上升；第7天，脯氨酸含量最高，達到峰值，3個品種平均為28.33 μg/g，其中金翠蕾中脯氨酸含量最高，為33.53 μg/g，比銀翠蕾、白云分別高出17.36%和46.55%；7 d后，脯氨酸含量又開始下降，第11天時達到最低點，3個品種平均為6.82 μg/g（見圖1）。金翠蕾、銀翠蕾、白云在干旱脅迫過程中脯氨酸平均含量分別為18.89、15.32、12.83 μg/g，這進一步說明金翠蕾的抗旱性最強，銀翠蕾次之，白云最弱。

圖1 干旱脅迫下植株體內脯氨酸含量變化Fig. 1 Changes of proline contents of 3 cultivars after drought

在整個干旱脅迫過程中，從植株外部形態變化來看，干旱脅迫初期，3個品種均無明顯變化；第7天，金翠蕾、銀翠蕾、白云均開始出現黃葉現象；第9、11天，葉片開始脫水和枯萎。這與體內脯氨酸含量第7天達到最大值，隨后又下降的變化趨勢是一致的。

2.3 水淹脅迫下脯氨酸含量變化

水淹脅迫第1～3天，白云和銀翠蕾體內脯氨酸含量下降，第3天開始上升，第5天后急劇上升，第7天達到峰值，分別為14.68 μg/g和12.83 μg/g；隨后，隨著水淹時間的延長，脯氨酸含量降低，銀翠蕾第11天達到最低值（4.55 μg/g），而白云在第9天達到最低值（4.98 μg/g），隨后略有升高，第11天升高到7.38 μg/g。水淹脅迫初期，金翠蕾脯氨酸含量降低較快，降低幅度較大，從最初的10.06 μg/g降到5.21 μg/g；當水淹脅迫第5天開始，脯氨酸含量才開始上升，第7天含量達到最高值（12.51 μg/g）后開始下降，第11天時達到最低點，為4.98 μg/g（見圖2）。整個脅迫過程中，3個品種體內脯氨酸含量均在第7天達到最高值，其中白云、金翠蕾、銀翠蕾的脯氨酸含量分別為14.68、12.51和12.83 μg/g，白云比金翠蕾和銀翠蕾分別高出17.38%和14.42%；從3個品種在整個脅迫過程中的脯氨酸含量均值來看，白云也比金翠蕾和銀翠蕾分別高出7.41%和11.97%。這說明抗澇性方面白云最強，而金翠蕾和銀翠蕾較弱，且兩者差異不大。

圖2 水淹脅迫下植株體內脯氨酸含量變化Fig. 2 Changes of proline content of 3 cultivars after water-logging

從植株外部形態變化來看，水澇脅迫初期，3個品種均無明顯變化；第7天開始，金翠蕾、銀翠蕾葉片開始出現枯萎，第11天植株枯萎，而白云仍保持較好的生長勢，抗澇能力仍較強。這也進一步說明3個品種中，白云抗澇性最強，金翠蕾和銀翠蕾稍弱。第9天后，白云體內脯氨酸含量回升，說明白云細胞自我調節能力較強，水淹一段時間后逐步恢復活力，耐水淹時間較長。

2.4 低溫脅迫下脯氨酸含量變化

低溫（0℃）時，3個品種脯氨酸含量均較常溫下高，平均值為64.16 μg/g。-10℃時，脯氨酸含量下降，平均值為52.57 μg/g；-20℃時，脯氨酸含量又上升，平均值達到64.14 μg/g，隨后脯氨酸含量又下降；-30℃時，3個品種脯氨酸含量均低于0℃時的含量，平均值為49.75 μg/g（見圖3）。3個品種中,金翠蕾脯氨酸含量始終保持最高，平均為65.20 μg/g，其次為銀翠蕾，平均值57.22 μg/g，白云最低，平均值為50.55 μg/g，說明金翠蕾體內積累了更多的脯氨酸，以此來抵御凍害的影響。

圖3 不同冷凍溫度下離體葉片內脯氨酸含量Fig. 3 Proline contents in vitro of 3 cultivars after freezing in leaves

3 討 論

植物相對含水量反映了植物在遭受水分脅迫后體內水分虧缺的程度，在干旱脅迫下，植物能維持較高的相對含水量，表明植株的葉片持水能力越強，抗旱性越強，因此，相對含水量是鑒定植物抗性行之有效的指標之一[6]。相對含水量與水分虧缺作為水分張力的兩個指標，表示樹木水分狀況和抗旱性大小，水分虧缺越小，相對含水量越大，樹木抗旱性越強。離體葉片失水率是評價葉片氣孔開閉能力的自行調節以及葉表面角質層蒸騰作用強弱的一個重要指標。金翠蕾相對含水量最高，白云相對含水量最低；金翠蕾水分虧缺最小，白云水分虧缺最大；金翠蕾失水率最低，白云失水率最高；銀翠蕾的相對含水量、水分虧缺和失水率均處于兩者之間。從相對含水量、水分虧缺、失水率這三組數據分析，金翠蕾抗旱性最強，銀翠蕾次之，白云最弱。

游離脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，在發生低溫、干旱、鹽漬等脅迫時，大部分植物均會積累大量的脯氨酸來保持細胞持水和生物大分子結構的穩定性，以適應逆境[7-10]，更重要的是對膜脂和蛋白起到保護作用，防止活性氧對膜脂和蛋白的過氧化作用[11]。

脯氨酸在干旱條件下的積累有利于增強組織的保水能力,使細胞保持一定的膨壓,維持各種正常的生理活動。在逆境下脯氨酸含量變化的研究很多，但結果各異。很多材料說明植物的抗旱性與脯氨酸含量存在相關性。隨著干旱時間的延長，植株體內脯氨酸含量呈上升趨勢，這在萬壽菊、棉花、茶樹、黃刺玫、光皮樹等植物上得到了很好的驗證[12-18]。本研究中，脯氨酸含量先下降后上升，第7天達到最高后又下降，第11天最低；從外觀上來看，7天后葉片開始變黃和萎蔫。這種先揚后抑的趨勢與多花胡枝子、荊條、榛子、溝葉結縷草、假儉草體內脯氨酸含量變化規律一致[19-20]，這是由于隨著干旱時間的進一步延長，植物組織發生萎蔫、碳水化合物供給不足、酶活性降低等原因，游離脯氨酸含量呈下降趨勢。脯氨酸含量變化與形態外觀綜合評價，研究結果說明，脯氨酸含量與抗旱性具有緊密的聯系，以游離脯氨酸含量高峰期出現的早晚及高峰期時的含量高低作為衡量抗旱性的標準是較為合理的。

同樣，在水淹初期，脯氨酸積累量小，隨淹水時間延長,植物體內的游離脯氨酸含量增加[21-22]。本研究中，水淹脅迫第7天，3個品種體內脯氨酸含量均達到最高值，隨后降低，其中白云脯氨酸含量最高；從外部表型來看，第7天，金翠蕾、銀翠蕾葉片開始出現枯萎，第11天植株枯萎，而第7天白云保持較好的生長勢，抗澇能力仍較強。脯氨酸含量變化與形態外觀綜合評價，研究結果說明，脯氨酸含量與抗澇性具有緊密的聯系，以游離脯氨酸含量高峰期出現的早晚及高峰期時的含量高低作為衡量抗澇性的標準是較為合理的。

脯氨酸作為植物細胞質的重要滲透調節物質，可反映植物對低溫的適應能力和抵抗能力[23]。有關抗寒性的研究已證明，低溫環境脅迫能刺激脯氨酸及其它氨基酸的合成及抑制其氧化降解，在低溫寒冷環境中，許多植物體內的脯氨酸含量增加[24-25]，從而提高蛋白質的穩定性，增強植物的抗逆性和對低溫寒冷的適應性[26-27]。

本研究中，0℃低溫時，3個品種脯氨酸含量均較常溫下高,說明低溫脅迫下，植株體內積累大量脯氨酸來抵御寒冷；其中，金翠蕾脯氨酸含量高于銀翠蕾和白云，說明其體內能積累更大量的脯氨酸，抗寒能力更強。

逆境脅迫對植物的影響是多方面的,逆境會破壞細胞膜結構的完整性,從而導致細胞膜選擇性吸收的喪失和細胞內電解質的滲漏。細胞膜的這種改變又會影響到植物其它的生理活動,如引起葉綠素降解、丙二醛含量積累，還能誘發植物體產生過量的活性氧自由基,激起植物體內抗氧化酶的活性增強和滲透調節物質的增加,以避免受活性氧自由基的傷害。因此，植物對逆境脅迫的反應不僅表現在植株外部形態上，也表現在體內滲透調節物質（可溶性糖、脯氨酸、丙二醛等）含量和抗氧化酶（超氧化物酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶等）活性的變化。本研究對逆境條件下植株體內脯氨酸含量變化的分析還只是一項初步研究，要研究金銀花的抗逆性，還必須從多方面入手，進行深入研究。

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Analysis on proline contents in 3 cultivars of honeysuckle under condition of stresses

СA? Neng1,2, WANG Xiao-ming1,2,3, ZENG Hui-jie1,2, L? Yong-xin1,2
(1. Hunan Academy of Forestry, Сhangsha 410004, Hunan, Сhina;2. Hunan Key Lab. of Trees Сlones Breeding Technology, Сhangsha 410004, Hunan, Сhina;3. Сentral South University of Forestry and Technology, Сhangsha 410004, Hunan, Сhina)

The relative water content, proline contentet al. in “Jincuilei” , “Yincuilei” and “Baiyun” which are 3 new cultivars ofLonicera macranthoideshave been determined, through treatments of under drought，water-logging and cold stresses. The results show that proline content fi rst increased and then showed a downward tendency under drought stress, “Jincuilei” showed high droughtresistant with highest Pro content, the order of drought tolerance from high to low was: “Jincuilei” ＞ “Yincuilei” ＞ “Baiyun”; proline content in “Baiyun” increased signif i cantly under water-logging stress, which indicated “Baiyun” had higher water-logging tolerance than “Jincuilei” and “Yincuilei”, which were similar in water-logging tolerance; Leaves in vitro of “Jincuilei” had higher proline content under cold and freezing, which indicated “Jincuilei” had higher cold tolerance, the order of cold tolerance from high to low was: “Jincuilei”＞ “Yincuilei” ＞ “Baiyun”.

honeysuckle; proline; drought tolerance; water-logging tolerance; cold tolerance

S789；Q945.78

A

1673-923X (2012)05-0161-05

2012-01-10

國家林業公益性行業科研專項 “金銀花、厚樸優良新品種創制及利用技術研究”(201104023)；長沙市科技計劃重點項目“抗甲流感金銀花新品種選育及示范”(K1003313-21)

蔡 能(1977-)，女，湖南益陽人，助理研究員，主要從事木本藥用植物遺傳育種及生理生化相關研究；

E-mail：nengcai@163.com

[本文編校：謝榮秀]