雙綠5號蠶豆根瘤菌的分離及其包衣處理的效果

陳小央

(勿忘農集團有限公司，浙江 杭州 310020)

研究結果表明，接種根瘤菌可以顯著地提高蠶豆的產量，增加土壤肥力［1-5］。因此，對浙江省主栽的蠶豆新品種雙綠5號［6］進行根瘤菌有效共生匹配篩選，開展蠶豆種子包衣技術試驗，對包衣效果進行初步比較，以期為蠶豆種子包衣商品化提供技術支持，進而提高蠶豆種子質量，加快雙綠5號種子的推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料

雙綠5號蠶豆種子由本公司生產。

根瘤菌培養基 (YMA):甘露醇10 g，酵母粉1 g，土壤浸出液200 mL，調整pH值為7.2，加入瓊脂粉 20 g，補足水至 1 000 mL。121℃下滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 蠶豆根瘤菌的分離與純化

菌種來源取自于雙綠5號蠶豆高產區蕭山農業對外綜合開發區17工段農場，選擇健壯株開花后結莢前拔取5株，檢查根瘤菌，挑選色鮮飽滿的根瘤進行分離。先用無菌水清理根瘤表面污泥，接著在75%酒精中清洗浸泡1 min，然后用升汞消毒根瘤表面，最后分別用75%酒精和無菌水清洗2遍，壓碎根瘤，用接種針蘸取瘤液在YMA平板上進行劃線分離，30℃培養2 d。挑取無色半透明粘稠的單菌落進行純化，純化方法見文獻［1，7］。

1.2.2 蠶豆根瘤菌回接菌株培養

將供試菌株先接到YMA斜面活化，然后轉接于裝有YMA液體培養基的三角燒瓶，30℃過夜培養至對數期，用平板法檢測含菌量為1億·mL-1。

滅菌處理。將試驗所需用的鑷子、培養皿、濾紙、玻璃棒包好，在121℃下滅菌30 min。分別稱取75 g蛭石裝入塞有紗布條的塑料杯中，在下層的玻璃瓶中注入50 mL蒸餾水，將裝有蛭石的塑料杯置于玻璃瓶上，再用牛皮紙包扎好，將其放入高壓鍋中間歇滅菌3 h，溫度為121℃ 。

蛭石栽培及接種。雙層缽法:將4粒正常萌發一致，根長1 cm左右的蠶豆種子置于發酵好的根瘤菌液中，浸泡15 min(以淹沒種子為宜)，用無菌鑷子夾取其植入裝有無菌蛭石的塑料杯中，每杯種植1粒，再沿各種子根部加入該菌液2 mL。在底層的供水瓶中裝入低氮營養液 (液面不能高于上層缽底部)，用牛皮紙封口 (所用材料均提前滅菌)，同時在牛皮紙中間剪一小洞 (直徑約1 cm)。同時設不浸泡接種根瘤菌的為對照，以上步驟均在超凈臺上進行，然后轉入光照強度為6 000～10 000 lx，晝夜溫度為 (25±5)℃，日照時數14 h的日光室中培養。待蠶豆生長35 d后收取。收取時用水沖洗凈根，分別測定每株蠶豆的有效根瘤數 (以呈現粉紅色為標準)、鮮瘤重、植株地上部干物重。

1.2.3 根瘤菌種衣劑不同藥種比較

將發酵液為主要成分，按照重量百分比與成膜劑配制成根瘤菌種衣劑，每處理稱取雙綠5號蠶豆種子 2 kg，按藥種比 1∶20，1∶35，1∶50 和 1∶70 分別折算種衣劑藥液重量，置于密封容器內搖勻后，在通風良好的室內自然晾干，溫度為 (27±2)℃，相對濕度約70%，觀察種子包裹效果，從每個處理的種子中隨機取出200粒，用目測法觀察包衣完整度。4～14 d測定發芽勢和發芽率，測定方法GB/T 3543.4—1995紙間法進行，4次重復，每處理100粒，結果進行生物統計。余下的種子播種進行田間試驗，隨機區組排列，小區面積3.33 m2，4次重復，四周設保護行，株距25 cm，行距100 cm，每穴播1粒。播后30 d，檢查成苗率，開花時檢查根瘤數，收獲后考查產量。

1.2.4 根瘤菌種衣劑包衣種子貯藏比較

6月收獲雙綠5號蠶豆種子，將種子按藥種比1∶35包衣好，自然晾干到水分符合國標 GB 4401.2—1996，用未包衣種子作對照。采用塑料袋密封包裝，在種子倉庫常溫下保存，分別于密封后15，30，60，90和120 d測定其發芽率，觀察種子發芽力情況。

2 結果與分析

2.1 蠶豆根瘤菌的分離與純化

從蠶豆新鮮株根系上分離到根瘤菌純化株1株R，在YMA平板上為無色半透明粘稠的圓形單菌落，隆起，表面光滑，有莢膜。

2.2 根瘤菌回接效果

將菌株R用雙層缽培養法培養，結果結瘤數(平均每株62.5個)顯著高于不接菌對照，鮮瘤重也明顯高于對照，證明分離的菌株R能有效侵染雙綠5號蠶豆根系，而且對蠶豆地上部分干物質積累的增加有顯著作用，與不接種的對照相比對莖葉干物質積累增加97.5%(表1)。

表1 根瘤菌回接處理的效果

2.3 根瘤菌種衣劑不同藥種比包衣種子效果

由表2可知，不同包衣藥種比對蠶豆種子的包衣處理效果差異明顯，除 1∶70外，1∶20，1∶35，1∶50包衣完整度81% ～90%。發芽率與發芽勢除了1∶20低于對照外，其余藥種比均高對照或相等。

表2 種衣劑不同藥種比處理的發芽情況

從表3結果可看出，在1∶20的藥種比時成苗率受到較大影響，根瘤數隨著藥種比的減少而減少，但均遠遠高于不包衣對照。包衣的處理有效分枝數、單株結莢數和鮮莢產量均高出不包衣對照，但鮮莢產量以藥種比1∶35的最高，顯著高于不包衣對照。

表3 根瘤菌種衣劑不同藥種比處理的效果

2.4 根瘤菌種衣劑包衣種子貯藏效果

從表4結果說明，用根瘤菌包衣雙綠5號種子進行一個常溫貯藏周期 (從收獲到播種)120 d，對發芽力沒有劣變的影響。

表4 根瘤菌種衣劑包衣種子不同貯存時間對發芽率的影響

3 小結與討論

根瘤菌對于蠶豆生產具有顯著的增產作用，可大大減少田間化肥用量，省工省本，對提高產品品質，降低環境污染具有重要意義。本試驗中純化的R菌株分離自雙綠5號蠶豆生長株根系根瘤，與雙綠5號蠶豆有很好的共生匹配性，可以作為生產上推廣應用的菌株。

雙綠5號蠶豆為大粒型圓扁形蠶豆，包衣時種子轉動速度慢，難度較大。為了達到包衣效果與成本兼顧的目的，種子包衣的藥種比以1∶35較為合適，若減少藥種比，提高包衣濃度，雖然能提高包衣均勻度和完整度，但會明顯增加包衣厚度，成本增加，又影響出苗，主要表現為根的正常生長受到抑制;而增加藥種比，降低包衣濃度，則使包衣不完整均勻，又影響菌肥效果。

根瘤菌包衣種子貯藏試驗結果表明，從當年6月蠶豆種子收獲，到9-10月播種，按1∶35的藥種比包衣處理，對發芽和田間成苗沒有明顯影響。但要注意包衣后種子包裝貯藏前水分必須在GB 4401.2—1996規定的范圍內，即≤12%，否則會對發芽成苗產生不良影響。

［1］ 奧巴托.共生固氮技術手冊 ［M］.蔣有繹，周楓，譯.北京:科學出版社，1987:109-113.

［2］ 王清湖，敬巖，張惠，等.提高蠶豆共生固氮效應的研究［J］. 土壤，1997(6):307-310.

［3］ 繆禮鴻，周俊初.根瘤菌競爭性研究進展 ［J］.華中農業大學學報，2003，22(1):84-89.

［4］ 王文麗，李娟，盧秉林.蠶豆根瘤菌的分離、篩選及其肥效研究 ［J］.干旱地區農業研究，2010，28(6):112-115.

［5］ 李愛萍，賴永紅，廖海林，等.蠶豆種子包衣技術及其應用效果 ［J］.福建農業科技，2002(5):28-29.

［6］ 張真，張彭達，應必鵬，等.蠶豆雙綠5號的種植表現及栽培技術 ［J］.浙江農業科學，2010(5):944-945.

［7］ 黃新，王亞琴，劉建新，等.接種根瘤菌對不同紫花苜蓿品種結瘤和生物學產量的影響 ［J］.浙江農業學報，2005，17(6):391-394.