血管內皮生長因子（VEGF）在血管外膜成纖維細胞的表達研究

沈頡

血管內皮生長因子（VEGF）在血管外膜成纖維細胞的表達研究

沈頡

目的 探討血管內皮生長因子及其受體在血管壁外膜成纖維細胞的表達。方法 采用ELISA方法來檢測外膜成纖維細胞血管內皮生長因子的分泌及TGF-β、bFGF、AngⅡ、PDGF對血管內皮生長因子分泌的影響，使用Western blot法觀察TGF-β、bFGF、AngⅡ、PDGF等對血管內皮生長因子I型受體表達的影響。結果 血管外膜成纖維細胞能夠分泌血管內皮生長因子。TGF-β能顯著增高血管內皮生長因子分泌（n＝5，P<0.05）,而PDGF、bFGF、AngⅡ對血管內皮生長因子分泌比較沒有統計學差異（n=5,P>0.05）。TGF-β、PDGF、bFGF、AngⅡ均可刺激外膜成纖維細血管內皮生長因子I型受體表達增高(n=4,P<0.05)。結論 血管壁外膜成纖維細胞可以分泌血管內皮生長因子，血管局部活性物質能有效刺激其受體表達增高。因此推測血管內皮生長因子可能介導血管外膜成纖維細胞參與血管壁的重構。

血管內皮生長因子（VEGF）；血管內皮生長因子I型受體（VEGFR-1）；血管外膜成纖維細胞(AFs)

血萎內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一類特異性地促進血管內皮細胞生長以及促進血管形成的生長因子，其作為一種有絲分裂原需與特異性受體結合，從而激活一系列的細胞信號通路。VEGF主要與2種酪氨酸激酶受體結合：VEGF 1型受體（vascular endothelial growth factor receptor-1）以及VEGF 2型受體（vascular endothelial growth factor receptor-2）。近期研究表明VEGF及其受體不僅可以在內皮細胞中表達，在許多非內皮細胞也有表達，且在這些非內皮細胞的表達與動脈粥樣硬化、高血壓血管改變等許多血管性病變密切相關[1-3]。

1996年Shi首次提出外膜重塑(vascular adventitial remodeling)的概念[4]，大量文獻證實血管外膜參與血管壁的重塑過程。文獻證實TGFβ1能誘導血管外膜成纖維細胞（adventitial fibroblasts,AFs）向肌成纖維細胞轉化參與血管新生內膜形成，并發現血管外膜成纖維細胞存在VEGFR-1的表達，且在VEGF刺激下，外膜成纖維細胞遷移活性增強。從而提示VEGF/VEGFR在血管外膜細胞上的表達具有功能上的意義[5]。本研究擬采用ELISA法檢測培養的血管外膜成纖維細胞中VEGF分泌，選取TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ與血管局部病理改變密切相關的刺激因素，觀察其對AFs細胞VEGF分泌及VEGFRs表達的影響，為AFs參與血管重構提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 清潔級SD大鼠，雄性,體重180～200g：上海BK公司；DMEM培養基、0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清：GIBCO公司；重組人b-FGF(100-18B)，重組人VEGF165（100-20），TGF-β(Cat No: 100-21R)：PeproTech EC Ltd；PDGFBB：R&D system；AngⅡ：Sigma公司；BSA:Sigma公司；多克隆兔抗VEGFR-1抗體（sc-316）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、單克隆小鼠抗β-actin：Santa Cruz；VEGF ELISA檢測試劑盒:晶美生物工程（北京）有限公司。

1.2 細胞培養及鑒定[5]

1.2.1 細胞培養 參照文獻采用組織貼壁方法進行血管外膜成纖維細胞的原代培養。具體如下：SD大鼠處死后，開胸取出胸主動脈，于DMEM培養基中分離周圍組織后，縱向剪開血管，剝除內膜后，分離中膜層和外膜層，將外膜層剪成1mm2大小的組織塊，使用10%胎牛血清的DMEM培養液貼壁培養、傳代，本研究使用的細胞為第4～6代成纖維細胞。

1.2.2 細胞鑒定 采用免疫細胞化學技術。將血管外膜成纖維細胞及中膜平滑肌細胞懸液分別滴種于蓋玻片上，放于細胞培養箱中，待細胞生長至適當密度取出，作以下處理：吸棄培養液，PBS漂洗3次，95%乙醇4℃固定10min，PBS漂洗3次，加封閉液室溫下作用20min，去封閉液，加1:100小鼠抗α-SM actin單抗37℃作用2h，PBS漂洗3次，加1:200辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG室溫下孵育1h，PBS漂洗3次，加DAB顯色，顯微鏡下觀察，適時終止反應，常規脫水，透明封片。

血管外膜成纖維細胞α-SM actin免疫染色呈陰性，而中膜平滑肌細胞表達α-SM actin呈陽性。

1.3 AFs細胞培養上清液中VEGF的分泌

1.3.1 細胞分組 將血管外膜成纖維細胞接種于φ6cm培養皿，予不含血清的DMEM培養液靜止48h后，共分2組：一組予2mL不含血清的DMEM培養液于普通CO2培養箱分別培養3、6、12、24、48、72h；另一組分別予2mL不含血清的DMEM培養液、2mL含10ng/mL TGF-β的DMEM培養液、2mL含10ng/mL bFGF的DMEM培養液、2mL含10ng/mL PDGF的DMEM培養液、2mL含10-7 AngⅡ的DMEM培養液于CO2培養箱培養24h；依次收集細胞的上清液。經低溫冷凍機干燥后用400μl無菌蒸餾水復溶[6]。

1.3.2 ELISA檢測 使用ELISA試劑盒測定細胞培養上清液中血管內皮生長因子含量。根據試劑盒說明制作標準曲線，取100μl樣品加入已包被抗血管內皮生長因子單抗的酶標板上，充分混勻后置37℃溫度下反應90min，洗板后加入生物素化的一抗1h，再次洗板后加入酶標二抗30min，然后加入酶底物15min，測定吸光度。計算樣品中VEGF的含量[7]。

1.4 Western blot法測定VEGFR-1表達 待血管外膜成纖維細胞培養至亞融合狀態，予不含血清的DMEM培養液培養48h。分別給予空白DMEM（對照）或含10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7M AngII的DMEM培養基刺激24h。抽提細胞總蛋白。電泳后轉膜，以脫脂奶粉封閉，標一抗（VEGFR-1，1:500）4℃過夜,二抗為辣根過氧化物酶標記抗體，于室溫下振搖約1h，X光壓片曝光后分析[5]。

2 結果

2.1 細胞鑒定 免疫細胞化學結果顯示:α-SM actin在血管平滑肌細胞呈陽性染色(棕黃色),而95%血管外膜成纖維細胞基本無著色,呈陰性（圖1）。

圖1 血管外膜成纖維細胞(上)、中膜平滑肌細胞（下）α-SM actin免疫組化染色圖（×200）。平滑肌細胞胞漿內可見到α-SM actin表達的棕黃色陽性染色，成纖維細胞中幾乎無陽性染色。

圖2 血管外膜成纖維細胞VEGF的分泌。A:細胞在無血清DMEM中培養0、3、6、12、24、48、72h后細胞上清液中VEGF分泌。B:細胞靜止48h后，在空白DMEM中培養24h及10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7AngⅡ刺激24h后細胞上清液中VEGF分泌。aP<0.05。

2.2 血管外膜成纖維細胞分泌VEGF ELISA結果（圖2）：AFs細胞能夠分泌VEGF。根據文獻所示，TGF-β、bFGF、PDGF在10ng/mL左右對成纖維細胞的作用活性最大，而AngⅡ在10-7左右活性最大[5,8]。TGF-β能顯著刺激AFs細胞的VEGF分泌（P<0.05）,bFGF、PDGF、AngⅡ對AFs細胞VEGF分泌影響不顯著（P>0.05）。

3.3 VEGFR-1在AFs細胞的表達 文獻證實血管外膜成纖維細胞存在VEGFR-1蛋白表達[5]。Western blot圖象分析示：TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ均可有效刺激AFs細胞VEGFR-1表達增高(n=4,P<0.05)。

圖3 VEGFR-1蛋白條帶位置在約180kD處。以空白DMEM作對照，10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7AngⅡ刺激AFs細胞對VEGFR-1表達影響的蛋白免疫分析圖。上圖為蛋白免疫印跡圖譜，下圖為灰度分析統計圖。與對照比較，aP<0.05,bP<0.01，n=4。

3 討論

既往，人們一直認為VEGFRs是局限于血管內皮細胞表達，許多關于VEGFRs的研究則都主要圍繞內皮細胞進行[1]。而后，越來越多的實驗證明VEGF/VEGF受體存在于在許多非內皮細胞。如：許多腫瘤細胞可表達VEGF受體。VEGF 2型受體可在造血干細胞、視祖細胞上表達。VEGF 1型受體在單核細胞、血管平滑肌細胞、中性粒細胞、腎間充質細胞等均有表達[1,9-10]。VEGF/VEGF受體在非內皮細胞的這種表達，還能介導細胞的許多生物學功能。如存在于單核細胞上的VEGF 1型受體能調節細胞化學趨化性及組織因子的釋放[10]；VEGF能促使血管平滑肌細胞分泌基質蛋白，促進其遷移功能增強等，骨髓祖細胞上的VEGFR-1介導細胞活化、動員等[11]。而這些細胞的功能與血管重塑、動脈粥樣硬化[1]等慢性炎性病變密切相關。由此可見，研究VEGF/VEGF受體在非內皮細胞表達有非常重要的意義。

本研究結果顯示：血管外膜成纖維細胞能夠分泌血管內皮生長因子。為了研究血管外膜成纖維細胞上的VEGFR-1是否與血管局部的病理改變有關。選取TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ等刺激因素。這些因素的作用與許多血管局部病變密切相關[12-13]。結果表明，這些因素均能促使血管外膜成纖維細胞的VEGF 1型表達增高，且TGF-β的作用最為顯著，同時ELISA結果所示TGF-β能顯著刺激VEGF的分泌。文獻證實TGF-β可通過影響血管外膜細胞增殖及肌成纖維細胞表型轉化等機制從而參與血管重塑[14]。因此推測VEGF可能也參與了這一機制。

在血管壁局部病理情況下，局部細胞環境的改變以及局部血管活性物質增高可刺激血管外膜成纖維細胞血管內皮生長因子分泌[15]增高以及內皮生長因子1型受體表達增高，而血管內皮生長因子則可以自分泌的形式刺激血管外膜細胞激活，遷移活性增強，這可能也是動脈粥樣硬化、血管重塑等病變的機制之一。

本研究存在一定的局限性。首先，研究結果未經過VEGF特異性拮抗劑拮抗VEGF的功能來證實。其次，其具體信號傳導機制還有待進一步研究闡明。這將是我們今后進一步研究的方向。

[1] 葛曉利,高平進.VEGFR-1與心血管疾病[J].中國微循環,2005,9(3)：219-222.

[2] Takahashi S.Vascular endothelial growth factor (VEGF),VEGF receptors and their inhibitors for antiangiogenic tumor therapy[J].Biological &pharmaceutical bulletin,2011,34(12):1785-1788.

[3] Kajdaniuk D,Marek B,Foltyn W,et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF)-part 1:in physiology and pathophysiology[J].Endokrynologia Polska,2011,62(5):444-455.

[4] Shi Y,O'Brien JE Jr,Fard A,et al.Transforming growth factorbeta 1 expression and myofibroblast formation during arterial repair[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1996,16(10):1298-1305.

[5] Jin X,Ge X,Zhu DL,et al.Expression and function of vascular endothelial growth factor receptors (Flt-1 and Flk-1) in vascular adventitial fibroblasts[J].J Mol Cell Cardiol,2007,43(3):292-300.

[6] George EM,Cockrell K,Adair TH,et al.Regulation of sFlt-1 and VEGF secretion by adenosine under hypoxic conditions in rat placental villous explants[J].Am J Physio-L-Reg I,2010,299(6):1629-1633.

[7] Sidell N,Feng Y,Hao L,et al.Retinoic acid is a cofactor for translational regulation of vascular endothelial growth factor in human endometrial stromal cells[J].Mol Endocrinol,2010,24(1):148-160.

[8] Li L,Zhu DL,Shen WL,et al.Increased Migration of Vascular Adventitial Fibroblasts from Spontaneously Hypertensive Rats[J].Hypertens Res,2006,29(2):95-103.

[9] Luttun A,Tjwa M,Moons L,et al.Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-Flt1[J].Nat Med,2002,8（8）：831-840.

[10] Ishida A,Murray J,Saito Y,et al.Expression of vascular endothelial growth f actor receptors in smooth muscle cells[J].J Cell Physiol,2001,188（3）: 359-368.

[11] Hattori K,Heissig B,Wu Y,et al.Placental growth factor reconstitutes hematopoiesis by recruiting VEGFR1(+)stem cells from bonemarrow microenvironment[J].Nat Med,2002,8（8）:841-849.

[12] 馬紹駿.轉化生長因子β1在血管損傷后再狹窄形成中的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（30）：5965-5968.

[13] Nam EH,Park SR,Kim PH.TGF-beta1 induces mouse dendritic cells to express VEGF and its receptor (Flt-1) under hypoxic conditions[J].Experimental & molecular medicine,2010,42(9):606-613.

[14] Gao PJ,Li Y,Sun AJ et al.Differentiation of vascular myofibroblasts induced by transforming growth factor-beta1 requires the involvement of protein kinase Calpha[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(9):1105-1112.

[15] Ahmad S,Hewett PW,Al-Ani B,et al.Autocrine activity of soluble Flt-1 controls endothelial cell function and angiogenesis[J].Vascular cell,2011,3(1):15.

Objective To explore the expression of VEGF and its receptors in adventitial fi broblasts. Methods Aortic adventitial fi broblasts from Sprague-Dawley (SD) rats were cultured. VEGF were measured in AFs by enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA), and TGF-β, bFGF,PDGF, AngⅡ on the VEGF secretion. the effect of TGF-β, bFGF, PDGF, AngⅡon the expression of VEGFR-1 was detected by western blot. Results Secretion of VEGF by adventitial fi broblasts. ELISA results showed that the VEGF protein was expressed in cultured serum-free medium (SFM) in time dependent manner(n=4, F=59.538,P=0.000)， and TGF-β can signifi cantly increase the VEGF expression. It suggested that VEGF can be secreted from fi broblasts into conditional medium.Western blot results showed that VEGFR-1 was expressed in fi broblasts. TGF-β(n=4,P＜0.01) , bFGF, PDGF,AngⅡ(n=4,P＜0.05) can increase the VEGFR-1 expression. Conclusion Our results demonstrated the existence of VEGF and its receptor VEGFR-1 in adventitial fi broblasts. This might be an important mediator in the pathogenesis of vascular remodeling.

VEGF（Vascular endothelial growth factor）, VEGFR-1（Vascular endothelial growth factor receptor 1）, Adventitial Fibroblasts(AFs).

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.24.013

200051 上海市長寧區同仁醫院 （沈頡）