解決氧化還原酶反應體系中輔酶問題的策略及其應用

江金鵬，吳旭日，陳依軍

中國藥科大學生命科學與技術學院 化學生物學研究室，江蘇 南京 210009

氧化還原酶是一類重要的生物催化劑。與化學催化劑相比，其催化的氧化還原反應具有反應條件溫和、立體選擇性強、副反應少和產物得率高等優點，約占所有生物催化反應的30%以上，并且隨著新酶的不斷發現和酶理性改造技術的發展，這一比例還在逐年升高[1-2]。雖然氧化還原酶能選擇性還原含羰基和醛類化合物為手性氨和手性醇[3-4]，并且這些產物可作為重要手性模塊在手性藥物制備、精細化工品生產及手性材料合成等多個領域具有巨大的應用前景，但是至今真正應用于工業生產的案例卻屈指可數。其根本的制約因素在于：1) 氧化還原酶需要輔酶的參與，而這些輔酶大多為煙酰胺類，主要是NAD+/NADH和NADP+/NADPH；2) 在工業生物催化應用中，通常需要人為添加外源性輔酶以完成催化反應，而煙酰胺類輔酶價格昂貴、穩定性差、難以重復利用，導致反應成本高昂。因此，如何降低輔酶用量和成本成為氧化還原酶工業化應用的一個重要課題。

經過較長時間的研究，人們已建立了多種方法用于提高輔酶的利用效率，降低反應中輔酶的成本，這些方法主要包括：采用酶法、電化學法、光化學法或化學法原位再生輔酶；利用代謝工程等手段改造細胞的代謝途徑，提高內源性輔酶的含量和利用率；研究輔酶替代物等。這些策略都能夠不同程度地改善反應體系中氧化還原酶的活性和輔酶的穩定性，實現輔酶及其替代物的重復利用，提高氧化還原反應的效率，降低生產成本，從而推動了氧化還原酶反應體系的工業化進程。

1 輔酶的體外循環再生

1.1 酶法循環再生

輔酶的酶法循環再生是指利用酶促反應實現還原態或氧化態輔酶的重復利用。由于操作簡單可控、選擇性高、穩定性好、再生體系與反應體系兼容性強以及共底物價格低廉等優點，目前仍是研究較多和使用較為廣泛的方法。根據實施策略的不同，酶法循環再生系統又分為兩類，第一類是底物偶聯法 (圖1)，即在反應體系中僅有一種氧化還原酶，該酶既能催化共底物再生輔酶，又能利用輔酶和底物合成產物。目前最為常用的底物偶聯系統有異丙醇 (IPA)-NADPH循環系統和乙醇-NADH循環系統。例如，美國Codexis公司以IPA作為共底物構建了IPA-NADPH輔酶再生體系，為氧化還原酶KRED催化合成抗哮喘藥物孟魯司特的手性醇中間體連續提供質子供體，使底物完全轉化成產物的最大濃度達到100 g/L[5]。雖然底物偶聯法簡化了反應體系并提高了輔酶的利用效率，但是該方法具有明顯的缺點：1) 僅利用一種酶在同一體系中催化兩個不同方向的反應，因此較難獲得最適反應的熱力學條件；2) 過量的共底物也會對酶產生抑制作用而降低催化效率。

另一類為酶偶聯法 (圖1)，即在一個反應體系中聯合應用兩種氧化還原酶催化不同反應，一個酶催化底物反應獲得產物，另一個酶催化共底物反應實現輔酶再生。該方法由于具有共底物價廉、反應的熱力學條件容易控制、輔酶再生效率高和循環穩定性好等優點，因此已成為應用最為廣泛的輔酶再生技術。目前常用的酶偶聯輔酶循環系統有：甲酸-甲酸脫氫酶 (FDH) 系統、葡萄糖-葡萄糖脫氫酶 (GDH) 系統、6-磷酸葡萄糖-6-磷酸葡萄糖脫氫酶系統以及亞磷酸-亞磷酸脫氫酶 (PTDH) 系統。例如，本實驗室從不動桿菌Acinetobacter baylyi ATCC 33305克隆了一種新的氧化還原酶，命名為雙羰基還原酶(DKR)[6-7]，構建了DKR和FDH的偶聯體系用于合成他汀類藥物手性二醇中間體。通過進一步引入水-正己烷兩相系統，該偶聯體系的底物濃度提高至105 g/L[8]，較大地降低了生產成本。

圖1 輔酶的酶法循環再生Fig.1 Cofactor regeneration by enzymatic reactions. (A) Substrate coupling method. E: enzyme for catalyzing two different reactions in one system. (B) Enzyme coupling method. E1: product-preparing enzyme; E2: cofactor regeneration enzyme.

除了在反應體系中添加氧化還原酶及相應的底物進行輔酶的循環再生外，利用微生物細胞內天然存在的氧化還原酶也能實現輔酶的循環再生。Yang等[9]發現南極酵母 Rhodotorula sp. AS2.224細胞粗提液中含有內源性甘露醇脫氫酶，并利用該酶再生NADPH，進而輔助羰基還原酶催化底物2-乙?；拎さ倪€原，轉化率高達96.8%，ee值大于99%。最近，Yan等[10]構建了羰基還原酶SCR1的大腸桿菌工程菌，證實了該菌的粗酶液中存在多種可用于NADPH再生的內源性氧化還原酶。經反應條件優化后，含有羰基還原酶SCR1的粗酶液能催化80 mmol/L的α-羥基苯乙酮的還原，轉化率高達90.1%，ee值大于99%，NADPH的總轉化數為3 604。此外，本實驗室也考察了大腸桿菌細胞內源性葡萄糖脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶再生輔酶的效率，發現補加葡萄糖能有效利用內源性氧化還原酶和DKR形成的偶聯體系催化合成他汀類藥物手性二醇中間體，其催化效率與DKR-FDH偶聯反應體系相當[11]。這些實驗結果表明，利用微生物細胞自身的氧化還原酶來實現輔酶再生的方法不僅能夠降低生產成本，而且使實驗操作進一步簡化，是一種有效的輔酶再生策略。但是，由于大多數天然存在的氧化還原酶存在表達量低、催化活性弱以及容易失活等缺點，其工業化應用的潛力并不大。

1.2 電化學法、光化學法和化學法循環再生

電化學法是利用電極提供或接受電子使還原態或氧化態輔酶再生的方法。該方法雖然具有反應體系簡單、不需外加第二個酶和共底物、成本低以及無副產物等優點，但也存在輔酶再生速率低、酶易失活、需要提供高電壓和電極易鈍化等諸多問題。盡管電極表面改性和新電子介體的尋找能夠在一定程度上解決上述問題，例如Kim等[12]制備的具有氧化還原性質的氧化錫電極能夠有效再生輔酶，將其與醇脫氫酶偶聯可以用于合成丙酮，但電極材料本身的性能局限導致該方法目前尚處于實驗室研究階段，需要繼續發展和完善。

光化學法采用光敏染料 (如亞甲藍) 經可見光照射激發后作為電子載體提供電子給氧化態輔酶而實現輔酶的再生。雖然該方法具有綠色環保、價格低廉等優點，但過于復雜的反應體系和低下的輔酶再生效率致使其至今還停留在實驗室研究階段，離實際應用還有一段距離。

輔酶的化學再生法就是利用化學電子供體如連二亞硫酸鹽將電子傳遞給氧化態的輔酶而實現NAD(P)H的再生。其中，利用廉價的氫氣以及性能優良的釕復合物分別作為最終還原劑和催化劑還原氧化態輔酶是一種富有潛力的輔酶再生系統[13]。然而，該系統的輔酶再生效率偏低與穩定性差等缺點不利于工業化應用，有待進一步研究。

2 細胞代謝與內源性輔酶

2.1 內源性輔酶再生系統的構建

在不影響微生物細胞自身正常代謝的情況下，利用基因工程技術向細胞內引入外源性氧化還原酶如GDH、PTDH和FDH，構建胞內輔酶再生系統以實現輔酶的循環利用是解決多酶、多底物輔酶再生系統兼容性和復雜性的有效手段。Berríos-Rivera等[14]將FDH引入大腸桿菌，加入甲酸后細胞內NADH的含量增加了1倍，乙醇脫氫酶催化合成乙醇的效率也隨之提高了15倍。針對體外輔酶再生體系效率低、操作繁瑣與穩定性差等缺點，本實驗室構建了DKR和GDH的共表達重組大腸桿菌，通過酶催化反應動力學分析和對工程菌細胞內輔酶濃度的實時監測，發現在全細胞催化反應過程中，當其他影響反應效率的因素均相同時細胞內輔酶濃度決定了全細胞的催化效率。在此規律指導下，通過優化反應條件，在不需外加輔酶的情況下，利用以上共表達菌株催化底物完全轉化為合成他汀手性側鏈的中間體——3R,5S-雙羥基酯化合物，且反應體系中底物濃度比單純表達dkr基因的細胞提高了15倍[15]，有效地解決了輔酶供應這一制約因素，為氧化還原酶的工業化應用提供了新的思路。然而，該方法并不能提高細胞內輔酶的總量，有時甚至需要添加外源性輔酶來增加細胞內輔酶的濃度以加速催化反應的完成。

2.2 培養基成分的優化

由于培養基組分對微生物次生代謝途徑影響較大，因此優化培養基的成分，尤其是碳源，在一定程度上能直接調節氧化態和還原態輔酶的含量及其比例。San等[16]向培養基中添加多種氧化形態的碳源 (葡萄糖，山梨醇和葡萄糖酸)，發現不同碳源導致大腸桿菌內 NADH/NAD+的比例產生較大差別，其原因在于不同氧化形態的碳源參與的糖酵解過程存在差異。此外，Liu等[17]在發酵培養基中加入 NAD+的生物合成前體煙酸 (NA) (圖2)，發現8 mg/L NA能夠有效促進細胞內NAD+的合成，從而增加了光滑球擬酵母Torulopsis glabrata細胞內產物丙酮酸的濃度。

2.3 輔酶合成途徑的改造

微生物細胞內的輔酶生成和降解始終處于一個動態的平衡過程，NAD (P) 的合成途徑主要分為從頭合成途徑 (De novo pathway) 和補救合成途徑 (Salvage pathway) (圖2)，其中改造補救途徑是增加內源性輔酶總量的常用手段。煙酸磷酸核糖轉移酶 (NAPRTase) 催化 NA磷酸化生成煙酸單核苷酸 (NAMN) 的反應是補救途徑的限速步驟。據此，Witholts等[18]對NAPRTase的結構和功能進行了系統研究，并將其在大腸桿菌中過量表達，使內源性煙酰胺輔酶的總量提高了5倍。Berrios-Rivera等[19]通過測定過量表達NAPRTase工程菌內的煙酰胺輔酶的含量，同樣證實了高活力的 NAPRTase能夠促進內源性輔酶的合成，并且NADH/NAD+比例隨NAPRTase活性的增加而降低。

在輔酶的補救途徑中，NAD+激酶 (NADK)催化NAD+發生磷酸化即可生成NADP+[20-21]。Lee等[22]在胸苷生產菌中過量表達了NADK后，內源性NADPH的含量增加到原先的1.3倍，胸苷的產率也隨之提高1.2倍。最近，另一新發現的NADK在構巢曲霉Aspergillus nidulans中被過量表達同樣能夠使內源性NADPH總量得到明顯提高[23]。

圖2 輔酶的從頭合成途徑與補救途徑Fig. 2 Cofactor NAD (P) biosynthesis through the de novo pathway and salvage pathway. 1: quinolinic acid (QA) sythetase; 2: QA phosphoribosyltransferase; 3: nicotinic acid monocleotide (NAMN) adenylyltransferase; 4: NAD sythetase. NADK: NAD+ kinase; NAPRTase: nicotinic acid phosphoribosyltransferase; DHAP: dihydroxyacetone phosphate; IA: iminoaspartate; dNAD: desamido NAD; NA: nicotinic acid; NMN: nicotinamide mononucleotide.

2.4 輔酶再生代謝途徑的調控

細胞內的代謝網絡由眾多復雜的代謝途徑所構成，通過對代謝網絡中輔酶再生和代謝途徑的調控可以改變內源性輔酶的存在形態和利用度。例如磷酸戊糖途徑 (PPP) 是再生還原態輔酶NADPH的主要代謝途徑，Poulsen等[24]通過在黑曲霉Aspergillus niger內過量表達PPP中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶，使內源性NADPH的濃度增加了2至9倍。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G6PDH)是PPP途徑中另一種生成NADPH的關鍵酶，通過在大腸桿菌中過量表達 G6PDH，可以使內源性NADPH/NADP+的比例提高6倍[25]。

雖然通過對 PPP的改造可以有效增加內源性NADPH的含量，但提高NADH的細胞內濃度則需要修飾其他代謝途徑，如甲醇氧化途徑。Pscheidt等[26]系統分析了畢氏酵母 Pichia pastoris的甲醇氧化途徑中 3個關鍵酶 (乙醇氧化酶、甲醛脫氫酶 (FLD) 和FDH) 的動力學性質，通過模擬和實驗發現 FLD是該代謝途徑中NADH再生的主要限制酶。因此，在P. pastoris中過量表達FLD就可達到有效再生NADH的目的。此外，在厭氧發酵過程中，乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原產生乳酸，同時消耗大量的NADH。為避免這一過程的發生，通過構建過量表達甘油脫氫酶和丙酮醛合酶的乳酸脫氫酶缺陷型突變株，不僅增加了內源性 NADH含量，而且利用該菌株催化合成 1,2-丙二醇的產率也提高了67%[27]。

雖然人們通過運用各種策略使細胞的代謝流分布發生改變以達到提高內源性輔酶總量并調節NAD (P)+/NAD (P) H比例的目的，但是由于細胞內的代謝網絡非常復雜，至今仍缺乏對輔酶相關代謝途徑的全面認識，精確調控內源性輔酶的含量及其形態還比較困難。因此，很有必要對胞內輔酶的代謝情況進行更深入的研究。最近，通過在大腸桿菌內過量表達NAD (H) 跨膜轉運蛋白NTT4并敲除NAD+合成基因nadE，獲得了能直接利用細胞外NAD (H) 的NAD+營養缺陷型工程菌株，利用該菌株測定了大腸桿菌內輔酶的濃度閾值[28]。這一研究結果進一步加深了人們對細胞內輔酶代謝情況的認識，也將有助于對內源性輔酶的含量和NAD (P)+/NAD (P) H比例進行更精確的調控，為有效設計輔酶依賴型氧化還原酶介導的全細胞反應體系提供了新的手段。

3 輔酶替代物的研究和應用

針對天然輔酶穩定性差、價格昂貴以及回收利用效率低等缺點，合成具有類似功能的替代物可能是解決輔酶現存問題的一條新途徑。

經過長期的努力，人們已經合成了眾多輔酶結構類似物，希望從中篩選到理想的天然輔酶替代物。迄今，研究較多的是一類含有煙酰胺結構的三嗪類染料，即活性藍2 (C.I. Reactive Blue 2，圖3)。由于該類染料能與氧化還原酶活性中心的輔酶結合位點相互作用，因此Burton等通過對眾多三嗪類染料的衍生物進行篩選，獲得了具有天然輔酶活性的化合物活性藍 N-3 (Blue N-3)[29](圖3)。但是，活性藍N-3結構中的蒽醌生色團在水溶液中的溶解度較差，并且因其在紫外-可見光范圍內具有較大吸收而不利于用光譜法監測反應過程。為了解決這些問題，活性藍N-3中的蒽醌生色團被替換成萘等基團，由此合成了一系列活性藍 N-3的衍生物[30-31]，并從中篩選到結構簡單、水溶性高、穩定性好以及紫外-可見光吸收值低的化合物CL4[32](圖3)，這使輔酶替代物研究又進了一步。然而，與天然輔酶相比，這類替代物的催化活性仍然較低。因此，如何進一步優化結構，提高催化活性，減少反應體系中的用量是該類輔酶替代物研究的重點。

圖3 NAD+，三嗪類染料活性藍2及輔酶替代物活性藍N-3，CL4的結構式Fig. 3 Chemical structures of NAD+, triazine dyes C.I. Reactive Blue 2, Blue N-3 and CL4.

輔酶依賴型細胞色素P450具有重要的催化特性，因此針對該類酶催化的氧化還原反應人們設計了多種輔酶替代體系[33-35]，其中采用含鈷的化合物 (Cobalt sepulchrate) (圖4) 作為輔酶替代物為細胞色素P450提供電子的體系最具代表性和最為典型[36]。Faulkner等[37]利用電化學法與cobalt sepulchrate偶聯為細胞色素P450連續提供電子，從而使P450催化月桂酸發生ω-羥化作用，并且反應速率與NADPH介導的P450體系相當。在此基礎上，為了改善水溶性和提高利用效率，Udit等[38]合成了親水性的NADPH替代物1,1’-二羧基二茂鈷 (圖4)。此外，為了進一步簡化反應體系和降低成本，Schwaneberg等用鋅粉作為電子供體構建了zinc：cobalt (III) sepulchrate系統。將P450 BM-3與這一新系統偶聯，其催化合成對硝基苯酚的效率達到了NADPH反應體系的20%[39]。雖然眾多研究表明，cobalt sepulchrate是一類較有潛力的輔酶替代物，但是反應過程中產生的過氧化物以及體系中存在的氧氣會影響cobalt sepulchrate和P450的活性，因此需要進一步研究對該體系進行優化。

圖4 鈷復合物的結構式Fig. 4 Structures of cobalt complexes. (A) Cobalt sepulchrate. (B) 1,1’-dicarboxycobaltocene cation.

1-苯甲基-1,4-二氫煙酰胺是另一類重要的NAD+結構類似物。將其與[Cp*Rh (bpy) (H2O)] (OTf)2偶聯，可以構建輔酶替代物化學再生系統。Lo等[40]利用該系統輔助馬肝醇脫氫酶催化合成手性芳香和烷基取代醇，產率達到 90%，ee值大于90%。隨后，該系統被應用于2-羥基-3-單加氧酶 (HbpA) 合成鄰苯二酚[41]以及P450突變體 (W1064S，R966D) 催化對硝基苯氧基癸酸的羥化反應[42]。由此可見，1-苯甲基-1,4-二氫煙酰胺作為某些氧化還原酶的輔酶替代物進行相應的催化反應具有良好的應用前景。但是，該替代物仍然存在活性低和水溶性差等問題。因此，今后的工作還需集中在尋找新的輔酶結構類似物，并對現有的輔酶替代物及與之匹配的氧化還原酶進行結構改造，以改善現有替代物的各種缺陷。

4 總結與展望

雖然氧化還原酶展現出巨大的應用前景并在化學工業綠色化的進程中發揮著重要作用，但至今真正用于工業化生產的案例卻屈指可數。其根本的制約因素是：絕大多數氧化還原酶需在煙酰胺類輔酶的參與下才能完成催化反應，而煙酰胺類輔酶價格昂貴、穩定性差并且難以重復利用，造成催化反應成本高昂。盡管近幾十年來人們針對輔酶問題已提出了多種解決方法，如構建輔酶循環再生系統、改造輔酶合成途徑、調控輔酶再生代謝途徑以及設計輔酶替代物等，并且取得了一些實質性進展，但是這些方法大多都存在各種各樣的問題和缺陷，嚴重阻礙了氧化還原酶在實際工業化生產中的應用。

基于輔酶工程的研究現狀和地球能源的逐漸枯竭以及人類環保意識的日益增強，采用理性設計或隨機篩選的方法獲得能夠直接利用水分子或氫氣作為電子供體完成氧化還原反應的獨特氧化還原酶，以及研究和完善有效的輔酶供應體系，將有可能從根本上解決輔酶問題，由此破解限制氧化還原酶工業化應用的瓶頸，進一步擴大氧化還原酶的應用范圍，真正實現重要化學品的綠色化工業制造。

[1] Straathof AJJ, Panke S, Schmid A. The production of fine chemicals by biotransformations. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13(6): 548?556.

[2] DeSantis G, Davis BG. The expanding roles of biocatalysis and biotransformation. Curr Opin Chem Biol, 2006, 10(2): 139?140.

[3] Huang Y, Liu N, Wu XR, et al. Dehydrogenases/ Reductases for the synthesis of chiral pharmaceutical intermediates. Curr Org Chem, 2010, 14(14): 1447?1460.

[4] Chen YJ, Chen C, Wu XR. Dicarbonyl reduction by single enzyme for the preparation of chiral diols. Chem Soc Rev, 2012, 41(5): 1742?1753.

[5] Liang J, Lalonde J, Borup B, et al. Development of a biocatalytic process as an alternative to the (?)-DIP-Cl-mediated asymmetric reduction of a key intermediate of montelukast. Org Process Res Dev, 2010, 14(1): 193?198.

[6] Wu XR, Liu N, He YM, et al. A bacterial enzyme catalyzing double reduction of a β, δ-diketo ester with unprecedented stereoselectivity [EB/OL]. [2011-10-20]. Nature Precedings, 2008, http://hdl. handle.net/10101/npre. 2008.1697.1.

[7] Wu XR, Liu N, He YM, et al. Cloning, expression, and characterization of a novel diketoreductase from Acinetobacter baylyi. Acta Biochim Biophys Sin, 2009, 41(2): 163?170.

[8] Wu XR, Chen C, Liu N, et al. Preparation of ethyl 3R, 5S-6-(benzyloxy)-3, 5-dihydroxy-hexanoate by recombinant diketoreductase in a biphasic system. Bioresour Technol, 2011, 102(3): 3649?3652.

[9] Yang W, Xu JH, Pan J, et al. Efficient reduction of aromatic ketones with NADPH regeneration by using crude enzyme from Rhodotorula cells and mannitol as cosubstrate. Biochem Eng J, 2008, 42(1): 1?5.

[10] Yan Z, Nie Y, Xu Y, et al. Biocatalytic reduction of prochiral aromatic ketones to optically pure alcohols by a coupled enzyme system for cofactor regeneration. Tetrahedron Lett, 2011, 52(9): 999?1002.

[11] Wu XR, Wang LL, Wang SZ, et al. Stereoselective introduction of two chiral centers by a single diketoreductase: an efficient biocatalytic route for the synthesis of statin side chains. Amino Acids, 2010, 39(1): 305?308

[12] Kim YH, Yoo YJ. Regeneration of the nicotinamide cofactor using a mediator-free electrochemical method with a tin oxide electrode. Enzyme Microb Technol, 2009, 44(3): 129?134.

[13] Wagenknecht PS, Penney JM, Hembre RT. Transition-metal-catalyzed regeneration of nicotinamide coenzymes with hydrogen. Organometallics, 2003, 22(6): 1180?1182.

[14] Berríos-Rivera SJ, Bennett GN, San KY. Metabolic engineering of Escherichia coli: increase of NADH availability by overexpressing an NAD+-dependent formate dehydrogenase. Metab Eng, 2002, 4(3): 217?229.

[15] Wu XR, Jiang JP, Chen YJ. Correlation between intracellular cofactor concentrations and biocatalytic efficiency: coexpression of diketoreductase and glucose dehydrogenase for the preparation of chiral diol for statin drugs. ACS Catal, 2011, 1(12): 1661?1664.

[16] San KY, Bennett GN, Berríos-Rivera SJ, et al. Metabolic engineering through cofactor manipulation and its effects on metabolic flux redistribution in Escherichia coli. Metab Eng, 2002, 4(2): 182?192.

[17] Liu LM, Li Y, Shi ZP, et al. Enhancement of pyruvate productivity in Torulopsis glabrata: increase of NAD+availability. J Biotechnol, 2006, 126(2): 173?185.

[18] Wubbolts MG, Terpstra P, van Beilen JB, et al. Variation of cofactor levels in Escherichia coli. Sequence analysis and expression of the pncB gene encoding nicotinic acid phosphoribosyltransferase. J Biol Chem, 1990, 265(29): 17665?17672.

[19] Berríos-Rivera SJ, San KY, Bennett GN. The effect of NAPRTase overexpression on the total levels of NAD, the NADH/NAD+ratio, and the distribution of metabolites in Escherichia coli. Metab Eng, 2002, 4(3): 238?247.

[20] Raffaelli N, Finaurini L, Mazzola F, et al. Characterization of Mycobacterium tuberculosis NAD kinase: functional analysis of the full-length enzyme by site-directed mutagenesis. Biochemistry, 2004, 43(23): 7610-7617.

[21] Mori S, Kawai S, Shi F, et al. Molecular conversion of NAD kinase to NADH kinase through single amino acid residue substitution. J Biol Chem, 2005, 280(25): 24104?24112.

[22] Lee HC, Kim JS, Jang W, et al. Thymidine production by overexpressing NAD+kinase in an Escherichia coli recombinant strain. Biotechnol Lett, 2009, 31(12): 1929?1936.

[23] Panagiotou G, Grotkjaer T, Hofmann G, et al. Overexpression of a novel endogenous NADH kinase in Aspergillus nidulans enhances growth. Metab Eng, 2009, 11(1): 31?39.

[24] Poulsen BR, N?hr J, Douthwaite S, et al. Increased NADPH concentration obtained by metabolic engineering of the pentose phosphate pathway in Aspergillus niger. FEBS J, 2005, 272(6): 1313?1325.

[25] Lim SJ, Jung YM, Shin HD, et al. Amplification of the NADPH-related genes zwf and gnd for the oddball biosynthesis of PHB in an E. coli transformant harboring a cloned phbCAB operon. J Biosci Bioeng, 2002, 93(6): 543?549.

[26] Schroer K, Luef KP, Hartner FS, et al. Engineering the Pichia pastoris methanol oxidation pathway for improved NADH regeneration during whole-cell biotransformation. Metab Eng, 2010, 12(1): 8?17. [27] Berríos-Rivera SJ, San KY, Bennett GN. The effect of carbon sources and lactate dehydrogenase deletion on 1, 2-propanediol production in Escherichia coli. J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, 30(1): 34?40.

[28] Zhou YJ, Wang L, Yang F, et al. Determining the extremes of the cellular NAD(H) level by using an Escherichia coli NAD+-auxotrophic mutant. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(17): 6133?6140.

[29] Burton SJ, Stead CV, Ansell RJ, et al. An artificial redox coenzyme based on a triazine dye template. Enzyme Microb Technol, 1996, 18(8): 570?580.

[30] Dilmaghanian S, Stead CV, Ansell RJ, et al. Synthesis and properties of a naphthalenecontaining artificial redox coenzyme. Enzyme Microb Technol, 1997, 20(3): 165?173.

[31] Ansell RJ, Dilmaghanian S, Stead CV, et al. Synthesis and properties of new coenzyme mimics based on the artificial coenzyme Blue N-3. Enzyme Microb Technol, 1997, 21(5): 327?334.

[32] Ansell RJ, Small DAP, Lowe CR. Characterisation of the artificial coenzyme CL4. J Mol Catal B: Enzym, 1997, 3(5): 239?252.

[33] Fang X, Halpert JR. Dithionite-supported hydroxylation of palmitic acid by cytochrome P450BM-3. Drug Metab Dispos, 1996, 24(11): 1282?1285.

[34] Vilker VL, Reipa V, Mayhew M, et al. Challenges in capturing oxygenase activity in vitro. J Am Oil Chem Soc, 1999, 76(11): 1283?1289.

[35] Munge B, Estavillo C, Schenkman JB, et al. Optimization of electrochemical and peroxidedriven oxidation of styrene with ultrathin polyion films containing cytochrome P450cam and myoglobin. ChemBioChem, 2003, 4(1): 82?89.

[36] Estabrook RW, Shet MS, Fisher CW, et al. The interaction of NADPH-P450 reductase with P450: an electrochemical study of the role of the flavin mononucleotide-binding domain. Arch Biochem Biophys, 1996, 333(1): 308?315.

[37] Faulkner KM, Shet MS, Fisher CW, et al. Electrocatalytically driven omega-hydroxylation of fatty acids using cytochrome P450 4A1. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(17): 7705?7709.

[38] Udit AK, Arnold FH, Gray HB. Cobaltocenemediated catalytic monooxygenation using holo and heme domain cytochrome P450 BM3. J Inorg Biochem, 2004, 98(9): 1547?1550.

[39] Schwaneberg U, Appel D, Schmitt J, et al. P450 in biotechnology: zinc driven ω-hydroxylation of p-nitrophenoxydodecanoic acid using P450 BM-3 F87A as a catalyst. J Biotechnol, 2000, 84(3): 249?257.

[40] Lo HC, Fish RH. Biomimetic NAD+models for tandem cofactor regeneration, horse liver alcohol dehydrogenase recognition of 1, 4-NADH derivatives, and chiral synthesis. Angew Chem Int Ed, 2002, 41(3): 478?481.

[41] Lutz J, Hollmann F, Ho TV, et al. Bioorganometallic chemistry: biocatalytic oxidation reactions with biomimetic NAD+/NADH co-factors and [Cp*Rh(bpy)H]+for selective organic synthesis. J Organomet Chem, 2004, 689(25): 4783?4790.

[42] Ryan JD, Fish RH, Clark DS. Engineering cytochrome P450 enzymes for improved activity towards biomimetic 1, 4-NADH cofactors. ChemBioChem, 2008, 9(16): 2579?2582.