宏基因組學挖掘新型生物催化劑的研究進展

王魁，汪思迪，黃睿，劉玉煥

中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275

宏基因組學起源于上世紀70年代土壤微生物基因組DNA的研究；1980年，Torsvik[1]建立了土壤細菌總DNA的直接提取方法；1991年，Pace研究組[2]通過構建環境樣品的DNA文庫篩選得到16S rRNA基因 (rDNA)，首次證明了從環境中克隆基因的可行性；1995年，Healy等[3]以木質纖維素底物富集培養后的微生物為樣品，通過構建基因組文庫，篩選得到纖維素酶，證明了從環境樣品中直接獲得生物催化劑的可行性；1996年，Stein等[4]通過構建海水樣品的基因組文庫篩選到了一個新的古菌 16S rRNA基因，確立了環境基因組學在挖掘新基因研究中的特殊地位。1998年，Handelsman 等[5]在前人研究的基礎上，首次提出了“宏基因組(Metagenome)”的概念并使用了“Metagenomics”這一名詞，由此宣告了宏基因組學(Metagenomics) 的誕生。宏基因組是指某一特定生境中全部微生物遺傳物質的總和，包含了可培養的和尚不能培養微生物遺傳信息的總和。所謂宏基因組學就是利用非培養的分子生物學技術、方法和手段，對宏基因組進行系統研究，即分析微生物在環境中的基因組集合，研究其群落結構、進化關系、相互協作關系與生態功能等。它繞過了微生物分離培養過程，成為研究環境樣品中高達 99%的不可培養微生物 (Uncultured microorganism) 的有力手段[6]，為后續的篩選提供更加全面和多樣的基因資源，有效地提高了新型生物催化劑的篩選效率。宏基因組學從誕生至今僅有十余年時間，但已引起了世界的廣泛關注。通過 SCI檢索發現，自 2002年以來關于宏基因組的研究報道已經超過1 200篇，而且呈現逐年升溫的趨勢 (圖1)。宏基因組學在新型生物催化劑的研究中取得了令人矚目的進展，成為國際生命科學技術研究的熱點和重點之一。其基本策略流程為：采集樣品；提取特定環境中的基因組 DNA；構建宏基因組文庫；篩選陽性克隆子；目的基因的亞克隆和表達；目的催化劑的生化特性分析 (圖2)。近年來研究者們已利用宏基因組文庫技術從不同環境樣品中篩選到了脂肪酶/酯酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等多種具有工業應用潛力的生物催化劑 (表1)。隨著宏基因組學在挖掘新型生物催化劑中的廣泛使用，我們進入了宏基因組學挖掘生物催化劑的時代[7]。本文著重從宏基因組學研究的樣品來源、宏基因組DNA的提取、宏基因組文庫的構建和目標克隆的篩選策略4個關鍵方面著手，系統綜述了采用宏基因組學方法進行新型生物催化劑研究的現狀，并對今后的研究和發展方向提出了展望。

圖1 近年來宏基因組學研究的報道情況Fig. 1 Research papers on Metagenomics in recent years.

1 宏基因組文庫的樣品來源

微生物數量巨大，種類繁多，廣泛分布于不同的物理化學環境，在自然界長期緩慢的進化過程中，已經產生了功能多樣的、在不同生理環境下具有高度精確性和特異性的生物催化劑，適應了各自的環境。所以，自然界的微生物中隱藏了一個巨大的寶藏，蘊藏著大量適于不同工業生產條件 (溫度、pH、壓力、離子強度和化合物濃度)的生物催化劑，且不同微環境中生物催化劑的種類和生化性質大不相同，而人們一直在尋找的某種生物催化劑很有可能已經存在于某一特定環境的微生物中了[7]。因此，在采用宏基因組學方法挖掘生物催化劑時，樣品來源格外重要。隨著構建的宏基因組文庫類型的日漸增多，Ivanova等[35]認為有必要將宏基因組文庫進行分類，以便對不同環境中的基因組信息進行比較分析。迄今為止，為了篩選生物催化劑，研究者們構建了各種各樣的環境樣品文庫，它們的樣品來源可歸為5大類：陸地環境，水生環境，寄生環境，人工環境及其他特殊環境 (表2)。

圖2 宏基因組學策略挖掘生物催化劑的流程圖Fig. 2 General process of metagenomic strategies in mining biocatalysts

表1 近年來構建的宏基因組文庫及篩選到的生物催化劑Table 1 Examples of isolated biocatalysts from metagenomic libraries in recent years

目前，宏基因組學研究的樣品主要來源于土壤環境和海洋環境。這是因為土壤具有微生物進行生長繁殖和生命活動所需的各種條件，是微生物生活的最適宜環境。據估計，每克土壤中含有高達10 000種不同的微生物[36]，這表明土壤微生物宏基因組是一個巨大的基因資源庫，對它們的挖掘能夠獲得大量的生物酶制劑[37]；而海洋環境在壓力、鹽分、溫度和營養成分上的極端變化賦予了海洋微生物在物種資源、基因功能和生態功能上無與倫比的生物多樣性。本實驗室從紅樹林、農藥污染的棉田、油田等環境的土壤樣品中篩選到了酯酶[18]、漆酶[25]、β-半乳糖苷酶[26]、阿魏酸酯酶[27]、單寧酶[28]，并在此基礎上研究了這些新型生物催化劑的酶學特性。

為了獲得性能更加多樣的生物催化劑，研究者們需要廣泛地采集環境樣品，特別是一些極端環境中的樣品。

表2 宏基因組文庫樣品來源的分類Table 2 Classification of samples used for metagenomic library construction

2 宏基因組DNA的提取

宏基因組DNA的提取是構建宏基因組文庫的關鍵步驟，因為環境樣品總DNA的濃度、純度、片段大小和偏好性等因素將直接影響宏基因組文庫的質量和代表性。DNA提取方法大體可分為兩類：直接提取法和間接提取法。

直接提取法，又稱原位裂解法，這類方法是通過物理法、化學法或酶解法直接裂解環境樣品中微生物的細胞壁來提取DNA并加以純化。目前常用的裂解方法中，物理法有反復凍融法、超聲法、玻璃珠擊打法、液氮碾磨法等；化學法所采用的化學試劑有表面活性劑 (如SDS)、鹽類、有機溶劑等；酶解法則主要采用溶菌酶和蛋白酶K。不同裂解法的差別在于細胞破壁的方式不同。直接提取法無需對環境樣品中的微生物進行復蘇處理，操作簡便，且樣品中的微生物能夠被裂解得比較完全，故DNA提取得率高，所獲得的基因組DNA能較好地反映樣品中微生物種群的多樣性。但由于操作過程中機械剪切力大，導致所獲得的 DNA片段較小 (1~50 kb)，且多為平端；此外，由于提取的基因組DNA中混有金屬離子、腐殖酸、多糖、多酚化合物等雜質，純度較低，往往還需要經過純化處理才能滿足后續分子生物學操作 (如DNA酶切、PCR擴增) 的需要。該法提取的DNA主要適用于以質?；颚耸删w為載體的小片段文庫的構建。

間接提取法，又稱異位裂解法，是利用梯度離心或者差速離心等方法先把微生物從環境樣品中分離出來，然后再用比較溫和的方法提取基因組 DNA。該方法受土壤中雜質的污染較小，提取條件比較溫和，所獲得的DNA純度較高，片段大 (20~500 kb)，適合于構建以柯斯粘粒(Cosmid) 和細菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome，BAC) 為載體的大片段文庫；但該方法操作繁瑣，前分離過程會造成部分微生物細胞的丟失，加上溫和條件下細胞壁較厚的微生物不易被裂解，因此所獲得的DNA中基因組信息的廣泛性不及原位裂解法，得率只有原位裂解法的1%~10%[37]。

從DNA產率、純度、片段長度及對整個微生物群落的覆蓋率等方面進行評價，直接法和間接法各有優勢和不足[38]?？傮w來看，國內外學者和研究人員采用直接提取法的較多。針對直接提取法得到的環境總DNA中雜質較多的問題，研究者們建立了多種 DNA提取純化方法。Zhou等[39]通過在基因提取過程中使用PVPP和CTAB去除多糖和腐植酸，獲得了適于建庫的高質量環境總 DNA，此方法在后來的宏基因組學研究中被廣泛采用；Braid等[40]通過絮凝作用有效地去除雜質；Desai等[41]采用溫和的裂解方法裂解土壤微生物，然后通過活性炭吸附和離子交換層析兩步法有效地去除了土壤中的離子和腐植酸等抑制劑，得到了可用于 PCR反應的高純度和高濃度土壤總DNA；Pang等[42]針對堆肥環境中高濃度腐殖酸的存在 (堆肥的腐殖酸含量比土壤高10~100倍)，使用Sephadex G200＋酸洗PVPP層析柱與電洗脫兩步純化的方法純化堆肥環境來源的DNA，成功地構建了一個含有10萬個克隆的柯斯質粒文庫，并從這個文庫中篩選到一個新的β-葡萄糖苷酶基因。本實驗室在Zhou法[39]基礎上進行改進，選用商品化的凝膠回收試劑盒對DNA粗提液進行純化回收，實驗操作簡單，回收效率高，采用此法構建了棉田土壤宏基因組文庫，并從中篩選得到一個具有菊酯農藥降解酶活性、阿魏酸酯酶活性和單寧酶活性的酶蛋白的基因[28]。

隨著宏基因組學的發展，許多新的DNA提取技術不斷被提出，使得人們可以從各種各樣的環境樣品中獲得高質量的總 DNA。然而，并沒有一種標準的或通用的環境DNA提取方法。任何DNA提取方法都存在一定的偏好性，導致選擇性地富集某些微生物的 DNA，同時選擇性地遺漏某些微生物的 DNA，從而影響所提取的DNA的種群覆蓋率。在實際應用中，應根據所研究生境的特性和研究目的進行選擇和優化。

3 宏基因組文庫的構建

3.1 載體的選擇

載體在宏基因組技術中具有重要地位，常用載體有質粒 (Plasmid)、細菌人工染色體 (BAC)、柯斯粘粒 (Cosmid)、福斯黏粒 (Fosmid)等，此外還有噬菌體P1克隆系統 (P1-clone)、由P1衍生 的 人 工 染 色 體 (P1-derived artificial chromosome，PAC)、酵母人工染色體 (Yeast artificial chromosomes，YAC)和哺乳動物人工染色體 (Mammalian artificial chromosome，MAC)等 (表3)。目前，在新型催化劑的研究中，所采用的載體有質粒、Cosmid、Fosmid、BAC、λ噬菌體以及各種穿梭載體等。載體的選擇應考慮以下因素：研究目的、所提取的環境總DNA的質量、欲插入目的片段的最大長度、所需要的載體拷貝數、欲采用的宿主以及篩選策略。如對腐殖質含量較高或剪切較嚴重的DNA樣品適宜構建質粒文庫，而對于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則適宜構建Cosmid、Fosmid或BAC文庫。但是，無論以何種載體構建文庫，都必須使文庫最大程度地覆蓋樣本中所有微生物的基因組。

3.2 宿主的選擇

宿主的選擇應考慮以下因素：所選擇的載體類型，宿主的轉化效率、重組載體在宿主細胞中的穩定性、宿主能否為相關功能基因提供必需的轉錄表達體系、對異源表達基因產物是否有較強的相容性、以及目標性狀 (如抗菌性) 缺陷型等。目前，構建用于篩選新酶的宏基因組文庫時，最常用的宿主為大腸桿菌E. coli，其優點在于操作簡單、繁殖迅速、培養代謝易于控制、遺傳信息明確。其次是芽胞桿菌 Bacillus、變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans 和 惡 臭 假 單 胞 菌Pseudomonas putida[8,43]。

表3 宏基因組文庫常用載體比較Table 3 Comparison of different vectors used in metagenomic library construction

4 目標克隆的篩選

由于環境樣品中微生物種類眾多，文庫容量龐大，如何有效得到目標克隆，是研究者們必須解決的一個難題。目前，從宏基因組文庫中篩選新型生物催化劑的策略可分為3種：基于活性的篩選，基于序列的篩選和底物誘導的篩選。

4.1 基于活性的篩選

基于活性的篩選 (Activity-based screening)，也稱功能驅動篩選 (Function-driven screening)，是指通過活性檢測手段從基因組文庫中獲得具有特殊活性的克隆方法。該方法經常借助于顯色反應、選擇性表型和形成水解圈等特性進行篩選，如 Diaz-Torres等[44]將構建的口腔唾液宏基因組文庫涂布于含有四環素的LB平板上，篩選得到了一個四環素抗性基因；本實驗室利用生色底物 5-溴-4-3-吲哚-辛酸鹽 (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-caprylate，X-cap) 和 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半 乳 糖 苷 (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-gal) 水解后會產生藍色物質的特性，從土壤宏基因組文庫中分別篩選到了多個酯酶基因[18]和 β-半乳糖苷酶基因[26]。目前已利用基于活性的篩選方法獲得了許多新型生物催化劑，如木聚糖酶、纖維素酶、酯酶和脂肪酶等[45]。該方法最大的優點是：不依賴于已知序列的信息，故能夠篩選到具有優良特性的酶。此外，該方法還可以快速鑒別有開發潛力的克隆子及全長基因，在工業生物催化劑的開發上具有一定的用途。但此方法也存在以下缺點：1) 由于目前DNA文庫的構建中所采用的克隆系統是大腸桿菌系統，真核生物的基因在這個系統中往往無法表達，因而提取到的宏基因組中存在的真核生物基因組DNA會影響到基因組文庫的篩選效率；2) 受所選擇的表達系統的影響 (宏基因組來源的基因轉錄效率低；翻譯效率低；外源蛋白質難以分泌到胞外；目標蛋白質由于缺乏分子伴侶形成不正確的折疊；缺乏合成的輔因子；與宿主菌密碼子使用存在差異)，導致許多基因無法正確表達而遺漏；3) 工作量大，篩選效率較低，有時需要分析幾千甚至幾萬個克隆子才能檢測到一個陽性克隆子。針對上述不足，研究者們提出了一些改進方法，如在DNA提取過程中，通過差速離心法去除樣品中的真核生物，從而減少總DNA中的真核生物DNA[42]；應用穿梭載體構建文庫，從而使宏基因組DNA能夠在大腸桿菌、鏈霉菌、或者假單胞菌中穩定表達[46-47]；也有對大腸桿菌進行修飾以增加基因的表達范圍[46]?？偠灾?，操作時應注意選擇合適的載體/宿主系統，優化篩選方法，這樣才能提高挖掘新型生物催化劑的效率。

4.2 基于序列的篩選

基于序列的篩選是以序列相似性為基礎，根據已知相關功能基因的保守序列設計探針或PCR引物，然后通過雜交或PCR擴增來篩選目標克隆。不斷擴大的基因庫為這種方法提供了堅實的基礎。迄今采用這種方法篩選到的新型催化劑有纖維素酶[11]、鐵過氧化物歧化酶[14]、脂肪酶[17]，延胡索酸酶[21]、木聚糖酶[32]等。與活性篩選法相比，該方法不依賴于重組基因在外源宿主中表達，且利用基因芯片技術、基因盒系統、熒光原位雜交技術 (Fluorescent in situ hybridization，FISH) 和微陣列技術 (Microarray)還可大大提高篩選效率，并有望獲得基因的全長序列。但是該方法仍然存在3個主要的缺陷：1) 由于探針和引物是基于已知序列的保守區域，而大部分具有實際用途的基因在序列上差相很大，通過 PCR擴增或探針雜交很難找到全新的同源基因，因此難以發現新型的酶分子，但有可能篩選到某一類結構或功能的蛋白質中的新分子；2) 一般只能獲得結構基因的一個片段，而不是全長基因；3) 對于新鑒定或推測的功能基因需要通過生化測定進一步驗證。

4.3 底物誘導的篩選

底物誘導篩選 (Substrate induced gene expression screening，SIGEX) 由Uchiyama等[34]于2005年首次提出，用于篩選那些受底物誘導的靶標基因。Uchiyama等成功的關鍵在于設計了一個具有操縱子陷阱 (Operon-trap) 的載體 (命名為 p18GFP)，該載體含有一個報告基因——綠色熒光蛋白基因 (gfp)，并將多克隆位點置于lac啟動子和gfp基因之間，使gfp基因的表達受到插入片段中啟動子的調控。這樣的設計保證了p18GFP載體既能用于構建文庫，又能使用熒光激活細胞分離儀 (Fluorescence-activated cell sorting，FACS) 進行高通量篩選[34,48-49]。Uchiyama等采用 p18GFP載體構建了一個含有152 000個克隆子的基因組文庫，并對文庫進行SIGEX分析：以苯甲酸鹽為底物得到58個陽性克隆子；以萘為底物得到4個陽性克隆子。整個篩選過程只用了4 d。由此可見，該方法靈敏度高、快速經濟，而且不需要對底物進行修飾；可以從底物推斷出目標基因的功能。但 SIGEX法存在以下缺陷：1) 無法利用不能進入細胞質的底物，從而無法誘導相關目的基因的表達。因此，SIGEX法不能用于篩選大分子底物的酶如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和木聚糖酶等[51]，而這些酶在工業上具有重要用途；2) 對目標基因的結構和插入方向敏感，容易導致漏檢，如SIGEX無法檢出組成型表達的目標基因，也無法檢出與gfp基因插入方向相反的目標基因[50-51]；3) 當分解代謝基因和 gfp基因之間存在轉錄終止子時，陽性克隆子無法被檢出，而大的插入片段中通常含有高豐度的轉錄終止子，所以SIGEX法不能有效篩選大片段插入文庫[51]；4) 有時僅能獲得基因的部分片段[49]；5) 對設備要求較高，應用受到一定的限制。

以上3種篩選方法各有優缺點，研究者應根據具體情況進行選擇。鑒于它們之間可以相互補充，因此，將它們巧妙結合可以大大提高宏基因組文庫的篩選效率。

5 展望

應用宏基因組學挖掘新型生物催化劑是宏基因組學研究中的一個重要方向，引起了全世界科研工作者的關注。但在研究過程中還存在一些亟待解決的問題。首先，現行的環境樣品 DNA提取方法還存在很多不足，導致某些環境樣品中的基因組DNA無法被有效提??；其次，目前使用的載體/宿主系統使得很多基因 (特別是真核微生物的基因) 無法進行異源表達，無法利用基于活性的篩選及底物誘導篩選兩種策略進行篩選；再次，現行的各種篩選方法都存在一些缺陷，無法對宏基因組文庫進行全面而有效的篩選；最后，篩選獲得的生物催化劑在酶學性質上還存在很多不足，無法應用于工業化生產。根據目前研究中存在的問題，可以從以下幾個方面著手：1) 與傳統的微生物分離培養技術相結合，使一些不可培養的微生物能夠進行富集培養，同時嘗試更多的環境樣品DNA提取純化方法，使提取的DNA在產率、純度、片段長度及種群覆蓋率等方面不斷提高；2) 探索更加適合構建宏基因組文庫的載體和真核表達宿主，同時與宏轉錄組學結合，挖掘存在于真核微生物中的生物催化劑；3) 與生物信息學結合，設計更加多樣、完備的探針和PCR引物，開發更加靈敏、快速、高效的檢測手段，提高篩選目標克隆的效率；4) 與蛋白質工程結合，對已獲得的生物催化劑進行改造以獲得高性能的工業生物催化劑。隨著生物學的不斷發展，DNA提取方法的突破，更適宜的載體和宿主的獲得，文庫構建水平和篩選效率的不斷提高，宏基因組來源的工業生物催化劑將會不斷地被挖掘出來，進而極大地推動工業生物技術的進步。

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