超聲波輔助提取桔梗皂苷方法的研究

王 鑫，徐麗萍，張海華

(哈爾濱商業大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱150076)

桔梗屬于大宗藥材品種，形似人參，藥食兩用，素有“南方人參”的美譽.桔梗不僅是一種傳統中藥［1］，還是一種食品，其中含有多種氨基酸，以及鈣、鎂、鐵、鋅、錳、銅、鉛、磷等人體必需微量元素，此外桔梗中還含有大量亞油酸等不飽和脂肪酸、多聚糖、無機鹽、甾體類化合物等［2］.桔梗中含有的大量亞油酸等不飽和脂肪酸，具有降壓降脂、抗動脈粥樣硬化等多種作用，由此可見桔梗是一種很好的功能性食品.桔梗的主要活性成分為桔梗皂苷(platycodin，PD)，桔梗中三萜皂苷經近幾年來的研究，已證明它在養禽業上具有重要的作用.三萜皂苷類有精神安定、放松肌肉和降溫的作用.還具有抗癌、抗腫瘤作用，可抑制癌細胞的增長，對消化系統尤其是胃癌效果明顯［3］.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

桔梗，市售.

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇(天津市天新精細化工開發中心);正丁醇(天津市博邊化工有限公司);濃硫酸(哈爾濱市新達化工廠);氫氧化鈉(天津市化學試劑三廠);鹽酸(天津市天新精細化工開發中心);三氯醋酸(天津市科密歐化學試劑有限公司);旋轉蒸發儀(上海申勝生物技術有限公司);雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 醇提法提取桔梗皂苷

將桔梗用烘箱烘干，用攪碎器攪碎.取10.00 g桔梗碎末放入錐形瓶中，加入95%的乙醇100 mL，振搖后在常溫下靜置1.5 h進行皂苷的提取，對提取液進行過濾，棄去濾渣，將濾液用旋轉蒸發器進行濃縮至1/3，得到的褐色黏稠液體再加入50 mL水飽和正丁醇進行萃取，取上清液至旋轉蒸發器濃縮并對水飽和正丁醇進行回收，將得到的淡黃色固體放入電熱恒溫干燥箱中在60～70℃下干燥至恒重，計算桔梗皂苷的提取率［4］.

1.3.2 超聲波輔助提取桔梗皂苷單因素的選擇

以桔梗皂苷提取率為指標，對比分析熱提法、冷浸法、醇提法，選出桔梗皂苷提取率較高的提取方法.根據實驗條件和相關文獻確定影響提取效果的因素，如乙醇體積分數、料液比、超聲溫度及超聲時間等.為了確定實驗中各因素對桔梗皂苷提取率的影響，進行單因素實驗.即改變某一條件，固定其他條件，測定桔梗皂苷提取率［5］.

1)乙醇體積分數單因素實驗

稱取5份等量的桔梗粉末，每份10.00 g于錐形瓶中，采用乙醇作為提取溶劑，分別選取乙醇體積分數為60%、70%、80%、90%、100%，在料液比1∶10，溫度40℃，超聲震蕩30 min條件下提取桔梗皂苷.以提取率為指標，考察乙醇體積分數對提取率的影響.

2)料液比單因素實驗

稱取5份等量的桔梗粉末，每份10.00 g于錐形瓶中，采用體積分數90%乙醇作為提取溶劑，物料與溶劑之比分別為1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12，在溫度40℃，超聲震蕩30 min條件下提取桔梗皂苷.以提取率為指標，考察料液比對提取率的影響.

3)超聲溫度單因素實驗

稱取5份等量的桔梗粉末，每份10.00 g于錐形瓶中，采用體積分數90%乙醇作為提取溶劑，按1∶10料液比，超聲震蕩30 min條件下分別在25、30、35、40、45℃提取桔梗皂苷.以提取率為指標，考察超聲溫度對提取率的影響.

4)超聲時間單因素實驗

稱取5份等量的桔梗粉末，每份10.00 g于錐形瓶中，采用90%乙醇作為提取溶劑，按1∶10料液比，溫度40℃條件下分別超聲震蕩20、30、40、50、60 min提取桔梗皂苷.以提取率為指標，考察超聲時間對提取率的影響.

1.3.3 超聲波輔助提取桔梗皂苷最佳條件的選擇

根據單因素實驗的結果，選擇影響提取效果的4個主要因素:乙醇體積分數(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D)，采用正交設計表L9(34)安排實驗.因素水平表見表1.

表1 因素水平表

1.3.4 定性定量分析實驗

1)桔梗皂苷提取率的測定

其中:m為桔梗皂苷質量，g;M為桔梗質量，g.

2)泡沫試驗

取桔梗皂苷提取液10 mL于試管中強列振搖，觀察其現象，記錄泡沫持續時間.

取2支試管，分別加入0.1 mol/L鹽酸液5 mL、0.1 mol/L氫氧化鈉液5 mL，再各加入桔梗皂苷溶液，分別調整pH值為1、13，強烈振搖，觀察其現象.如溶液pH分別為1、13，兩支試管所形成的泡沫高度相同，則桔梗皂苷中含三萜皂苷，如pH為13的堿管泡沫較pH為1的酸管泡沫高數倍，則桔梗皂苷中含甾體皂苷(中性皂苷的水溶液在堿性溶液中可形成較穩定的泡沫，借此可與酸性皂苷區別).

3)三氯醋酸反應試驗

皂苷與三氯醋酸試劑反應產生顏色變化，在60℃時能顯紅色－紫色變化的為甾體皂苷，在100℃時才出現紅色－紫色的變化，為三萜皂苷［6］.將桔梗皂苷溶液滴在濾紙上，噴三氯醋酸試劑，加熱，觀察在不同溫度下其顏色變化.

2 結果與討論

2.1 醇提法提取桔梗皂苷結果與分析

從表2中可以看出，采用醇提法提取的桔梗皂苷提取率較高為3.17%.由此可見，不同的溶劑對浸提效果有顯著的影響，采用乙醇作為提取溶劑桔梗皂苷提取率較高［7］.

表2 實驗參數值

2.2 超聲波輔助提取桔梗皂苷單因素結果與分析

通過對比桔梗皂苷提取率確定最佳提取方法為超聲波輔助醇提法.選取影響超聲波輔助醇提法效果的主要因素:乙醇體積分數、料液比、超聲溫度、超聲時間，分別進行單因素實驗，以桔梗皂苷提取率為指標，確定影響桔梗皂苷提取的，為正交試驗提供依據.

2.2.1 乙醇體積分數單因素實驗結果與分析

實驗結果顯示，隨著乙醇體積分數的的升高桔梗皂苷提取率顯著增加，當乙醇體積分數為90%時，桔梗皂苷提取率達到最高點，繼續升高乙醇體積分數桔梗皂苷提取率呈下降趨勢.因此，選定90 %的乙醇為最佳體積分數.由此看出，乙醇體積分數是提取過程中的一個重要因素.利用乙醇的溶解性，將乙醇作為溶劑對物質進行分離提純，主要與其低碳直鏈醇的性質有關，分子中的羥基可以形成氫鍵，因此乙醇黏度很大，也不及相近相對分子質量的有機化合物極性大.見圖1.

圖1 乙醇體積分數對桔梗皂甙提取率的影響

2.2.2 料液比單因素實驗結果與分析

實驗結果顯示，隨著料液比的減少桔梗皂苷提取率顯著增加，見圖2.當料液比為1∶10時，桔梗皂苷提取率達到最高點，繼續降低料液比桔梗皂苷提取率呈下降趨勢.因此，選定1∶10的料液比為最佳比例.液料質量比是提取過程中的一個重要因素，從傳質速率的角度講，主要表現影響固相和液相主體之間的質量濃度差，即傳質推動力.液料質量比小，提取過程中液相質量濃度增加快，兩相間的質量濃度差減少加快，從而使傳質推動力衰減加快.其次，液料質量比的大小會影響兩相的混合情況，尤其在攪拌不充分的情況下，將改變傳質系數，而影響傳質速率.液料質量比的提高必然會在較大程度上提高傳質推動力，但也提高了生產成本及后處理難度.

圖2 料液比對桔?？傇碥仗崛÷实挠绊?/p>

2.2.3 超聲溫度單因素實驗結果與分析

由圖3可知，隨著溫度的升高，桔梗皂苷提取率增加，在超聲溫度為40℃時桔梗皂苷提取率達到最高點，超聲溫度繼續升高時，桔梗皂苷提取率呈下降趨勢.而且在長時間、溫度較高的條件下，活性成分被破壞，綜合考慮，確定超聲溫度為40℃為最佳溫度.由此可以看出，超聲溫度對提取的皂苷提取率有一定的影響.通常來說溫度升高，其滲透、溶解、擴散速度加快，所以提取效果較好，但溫度過高也會使一些不耐熱的成分破壞，同時雜質溶出量也隨著增多.因此，超聲溫度要適宜.

圖3 超聲溫度對桔?？傇磉疤崛÷实挠绊?/p>

2.2.4 超聲時間單因素實驗結果與分析

由圖4可知，隨著超聲時間的延長桔梗皂苷提取率顯著增加，在超聲時間30 min時桔梗皂苷提取率達到最高點，繼續延長時間，桔梗皂苷提取率呈下降趨勢.因此，為獲得較好的提取效率并考慮節約能源，確定超聲時間為30 min.由此可以看出，超聲時間對提取的皂苷提取率有一定的影響.但需要指出的是超聲時間過長也可能使皂苷類成分生物活性受到破壞，有效成分不再被溶解，同時雜質溶出量也隨之增多，因此，超聲時間要適宜.

2.3 超聲波輔助提取桔梗皂苷最佳條件結果與分析

通過正交實驗確定最佳的提取方法，考察指標為桔梗皂苷提取率(%)，其實驗結果見表3.

表3 正交試驗結果表

圖4 超聲濕度對桔?？傇磉疤崛÷实挠绊?/p>

通過比較正交試驗表中各因素的極差值(R)，可以看出，影響桔梗皂苷提取率因素順序為A＞B＞C＞D，最佳提取條件為A2B3C3D2，即乙醇體積分數90%、料液比1∶11、超聲溫度45℃、超聲時間30 min.通過驗證試驗，采用最佳工藝條件提取桔梗皂苷，提取率為4.255%.

2.4 定性定量分析實驗結果與分析

2.4.1 泡沫試驗結果分析

圖5、6所示，桔梗皂苷溶液經振搖后產生持久性泡沫15 min以上(即為陽性反應)且2支試管產生泡沫的高度相同，由此可以證明桔梗皂苷中含有三萜皂苷.

2.4.2 三氯醋酸反應試驗結果分析

桔梗皂苷在100℃顯示紅色－紫色，進一步證明其含有三萜類皂苷.

3 結語

采用桔梗為原料，以桔梗皂苷的提取率為指標，對超聲波輔助提取桔梗皂苷的方法進行研究.以乙醇為主要提取溶劑，選擇乙醇體積分數、料液比、超聲溫度和超聲時間為影響因素提取桔梗皂苷，以桔梗皂苷提取率為指標，采用正交試驗確定最佳提取方法，桔梗皂苷最佳提取條件為:乙醇體積分數90%、料液比1∶11、超聲溫度45℃、超聲時間30 min，提取率為4.255%.通過泡沫試驗和三氯醋酸反應試驗判定從桔梗中所提物質為三萜皂苷.

［1］ 矯艷春.桔梗資源的開發與利用［M］.通化:吉林省通化市教育學院，2000.

［2］ 何美蓮，程小衛，陳家寬，等.桔梗皂苷類成分及其質量分析［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16(6):457.

［3］ 宋 楊，齊云.桔梗的藥理研究進展［J］.中國藥房，2006，17(2):140－141.

［4］ 李喜風，薛秋萍，藿誠明.桔梗中總皂苷的含量測定［J］.中醫藥學刊，2006，12(24):2232.

［5］ 吳玉蘭，丁安偉，包貝華.炒酸棗仁中酸棗仁皂苷的提取純化方法研究［J］.中藥材，2005，28(3):219－223.

［6］ 鐘露苗.三萜皂苷提取分離和結構鑒定技術［J］.中醫藥學刊，2004，22(4):760－762.

［7］ 徐麗萍，刑 超，王 鑫，等.酶解法制備大豆低聚肽工藝的研究［J］.哈爾濱商業大學學報:自然科學版，2012，28(2): 143－146.