低場核磁共振研究熱燙對纖絲干酪水分狀態的影響

苗 穎 趙 征

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.天津農學院食品科學系，天津 300384）

Mozzarella干酪是意大利Pasta Filata（帕斯特－費拉特）干酪中的一種［1］。在Mozzarella干酪制作過程中，在熱水中揉捏處理干酪凝塊時，可賦予成品干酪特有的纖維結構、融化性和拉伸性，因此Mozzarella干酪在整個干酪加工中占有重要地位［2，3］。纖絲干酪（string cheese）是Mozzarella類干酪的一種直接食用的產品，由于纖絲干酪進行熱燙拉伸處理時熱燙溫度高于其它Mozzarella類干酪，因此其成熟時間短，制作周期短，同時可以用手撕下干酪的纖維，口味柔和清談，采用真空包裝，保質期長，作為休閑食品直接食用，具有較高的附加值。水分子的狀態和水分子的流動性情況對纖絲干酪的功能特性有顯著影響，因此研究熱燙溫度對纖絲干酪水分狀態的影響對纖絲干酪的生產具有重要意義。

Mozzarella干酪特有的熱燙拉伸過程使其微觀結構不同于其它種類干酪。Oberg等［4］通過電子顯微鏡觀察到熱燙拉伸過程賦予Mozzarella干酪平行方向的蛋白纖維網絡結構，同時在蛋白纖維束空隙間存在水和脂肪球，蛋白纖維束空隙間自由水的聚集對干酪的持水力是不利的。Guo等［5］觀察到在Mozzarella干酪制作完成的初期，干酪會滲出水分，在新切割的干酪表面，水分滲出現象會更加明顯。近年來，低場核磁共振技術（low field－NMR）廣泛應用于生物體系中結合水的研究。它可以測定能反映水分子流動性的氫核的縱向弛豫時間和橫向弛豫時間，分別稱為自旋－晶格弛豫（T1）和自旋－自旋弛豫（T2）。各個系統內水分含量和分布不同都會造成T1和T2弛豫時間的快慢變化［6，7］。T2弛豫時間比T1弛豫時間對水分分布狀態更加敏感。通過分析T2弛豫時間的不同，較容易區分出易流動損失的水分和通過物理、化學作用緊密結合的水分［8］。Aylin Altan等［9］利用低場核磁共振儀研究了Feta干酪鹽浴期間水分狀態變化。Raffaella Gianferri等［10］購買了5種品牌由水牛乳制作的Mozzarella干酪，利用低場核磁共振儀對5種Mozzarella干酪的16d成熟期內的水分狀態進行了比較。至今為止尚無熱燙溫度對纖絲干酪水分狀態影響的研究。本試驗利用低場核磁共振技術研究熱燙溫度對纖絲干酪水分狀態的影響，旨在揭示纖絲干酪貯藏過程中水分狀態的變化規律，為纖絲干酪的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料

原料乳：每100mL原料乳中蛋白質質量為3.17g、脂肪質量為3.52g、水分為87.76g，原料乳pH 值為6.75，購自塘沽奶牛養殖場；

TCC－3直投式菌種：丹麥科漢森有限公司；

Stamix1150凝乳酶：含質量分數50%牛胃蛋白酶和質量分數50%小牛皺胃酶，酶活力1 070U／g，丹麥科漢森有限公司。

1.2 主要儀器和設備

電子天平：JT201N 型，上海精天電子儀器有限公司；

酸度計：FE20型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

多功能氣調封口機：DZ400－JO 型，溫州中聊包裝機械有限公司；

臺式高速平衡離心機：L420型，北京雷勃爾離心機有限公司；

核磁共振分析儀：NMI20 型，上海紐邁電子科技有限公司；

單螺旋干酪拉伸機：TUST800 型，Φ57 mm×300 mm，天津科技大學自制。

1.3 試驗方法

1.3.1 纖絲干酪工藝流程

新鮮牛乳→過濾→巴氏殺菌→冷卻→加發酵劑、CaCl2→凝乳酶凝乳→切割→加熱收縮→排乳清→堆釀→加鹽→熱燙、拉伸→成型→冷卻→包裝→成品［11］

1.3.2 纖絲干酪可榨乳清質量分數的測定 不同熱燙溫度樣品在0～4 ℃溫度下保存，分別在貯存的第1、4、7、10天測定其可榨乳清質量分數?？烧ト榍遒|量分數測定方法：稱取15g左右樣品于離心管中，在25℃（室溫）12 500r／min條件下離心60min，棄去上清液并用濾紙吸干離心管壁殘留的水分，最后計算可榨乳清占15g樣品量的百分比，即代表干酪持水力［12］?？烧ト榍遒|量分數越低，表明干酪的持水力越高。

式中：

R—— 可榨乳清質量分數，%；

m1—— 離心前樣品質量，g；

m2—— 離心后樣品質量，g。

1.3.3 自旋－自旋弛豫特性分析 干酪樣品在0～4 ℃溫度下保存，分別在貯存的第1、4、7、10天測定樣品的自旋－自旋弛豫時間T2（ms）。樣品直徑10mm，高度約為15mm，裝于15mm 外徑的試管底部，置于磁場中心位置的射頻線圈的中心，利用硬脈沖自由感應衰減信號（free induced decay，FID）調節共振中心頻率，然后進行多脈沖回波序列（carr－purcell－meiboom－gill，CPMG）掃描試驗，輪流采樣，每個樣品測試3遍［13］。儀器參數：90°脈寬為9.5μs；180°脈寬為19μs；采樣點數為375 146；采樣譜寬為250kHz；重復時間為1 500ms；累計掃描4次；回波時間100μs；回波個數為7 500。

低場核磁弛豫測量得到的圖為多指數衰減曲線，其數學模型為：

式中：

A（t）—— 衰減到時間t時的幅值大??；

t—— 衰減時間，ms；

A0i—— 第i個組分平衡時的幅值大??；

T2i—— 第i個組分的自旋－自旋弛豫時間，ms。

CPMG 指數衰減曲線用儀器自帶的 MultiExp InvAnalysis軟件進行反演，得到T2值。該軟件使用整體迭代修正的NMR 弛豫信號多指數反演算法，結果為離散型與連續型相結合的T2譜。為了分析方便，采用弛豫圖每個組分峰值對應的時間作為T2，而弛豫峰的寬度為基線上峰底的寬度［14］。

1.4 數據處理

試驗數據用STATISTIX 8.1軟件進行處理，試驗數據采用完全隨機設計方差分析，均數之間采用LSD 多重比較進行差異顯著性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 熱燙溫度對纖絲干酪可榨乳清質量分數的影響

纖絲干酪經過熱燙拉伸過程后會形成平行方向的副酪蛋白纖維網絡結構，同時在副酪蛋白纖維束空隙間存在著水和脂肪球，可榨乳清即為位于副酪蛋白纖維束空隙間的水分，它的聚集對干酪的持水力不利［4］，可榨乳清質量分數降低表明干酪的持水力升高。不同熱燙溫度制作的纖絲干酪可榨乳清質量分數隨貯藏時間的變化見圖1。由圖1 可知，隨著干酪貯藏時間的延長可榨乳清質量分數呈下降趨勢，表明干酪在成熟過程中持水力升高。這是由于在干酪成熟過程中副酪蛋白纖維網絡吸水膨脹，體積擴大，侵占了脂肪球與可榨乳清原來存在的空間，致使原來部分蛋白之間的相互作用被蛋白與乳清水分子之間相互作用取代，蛋白水合區域增加，水合作用增強。由于蛋白質的水合區域增加，副酪蛋白纖維網絡可以容納更多的額外的水分子，引起可榨乳清質量分數下降，干酪持水力增強［9，10］。

由圖1還可以看出，在纖絲干酪制作1d后可榨乳清質量分數大小為75 ℃樣品＞85 ℃樣品＞95 ℃樣品，即干酪持水力大小依次為95 ℃樣品＞85 ℃樣品＞75 ℃樣品，在纖絲干酪貯藏10d后可榨乳清質量分數大小依次為95℃樣品＞85 ℃樣品＞75 ℃樣品，即干酪持水力大小依次為75 ℃樣品＞85 ℃樣品＞95 ℃樣品，說明隨著貯藏時間的延長，熱燙溫度低的樣品，干酪的持水力較好。這是由于熱燙拉伸過程引起干酪中凝乳酶和乳酸菌蛋白酶的失活，熱燙溫度越高凝乳酶和乳酸菌蛋白酶失活越嚴重，進而影響蛋白水解程度，導致蛋白水合區域面積下降造成的。

圖1 不同熱燙溫度的纖絲干酪可榨乳清質量分數隨貯藏時間的變化Figure 1 Changes in expressible serum in string cheese with three different stretching temperature under different storage

2.2 熱燙溫度對纖絲干酪水分狀態的影響

CPMG 指數衰減曲線擬合得到2 個組分的數據，即T21、T22。表1為不同熱燙溫度的纖絲干酪T21和T22隨貯藏時間的變化。T21弛豫時間變化范圍為5～17ms，代表與干酪中的蛋白質結合緊密的結合水；T22弛豫時間變化范圍為35～65 ms，代表與干酪中的蛋白質結合松散的自由水［15，16］。自旋－自旋弛豫時間T2反映了樣品內部氫質子所處的化學環境，與氫質子所受的束縛力及其自由度有關，而氫質子的束縛程度又與樣品的內部結構有密不可分的關系，氫質子受束縛越大或自由度越小，T2弛豫時間越短；反之則T2弛豫時間越長，因此T21代表的結合水比T22代表自由水受束縛程度高，即自由度小。由于干酪中的另一主要組成物質脂肪是疏水的，因此纖絲干酪中的水分子一定受干酪中蛋白質束縛程度不同，或者與蛋白質緊密結合或者遠離蛋白質。

由表1可知，不同熱燙溫度制作的纖絲干酪樣品T21、T22隨著貯藏時間的延長均呈上升趨勢，在干酪成熟10d后，75 ℃樣品T21上升了173.8%，T22上升了49.0%；85 ℃樣品T21上升了133.3%，T22上升了40.7%；95 ℃樣品T21上升了102.8%，T22上升了30.4%，說明不同熱燙溫度制作的纖絲干酪內部的結合水和自由水隨著貯藏時間延長自由度均增大，且自由度增加幅度大小依次為75 ℃樣品＞85 ℃樣品＞95 ℃樣品，即熱燙溫度越低自由度增幅越大。揭示了纖絲干酪中的蛋白質在拉伸成型后并不是靜態的而是進行了結構重排［17］，副酪蛋白纖維網絡內蛋白質的水解和酪蛋白的脫鹽作用引起蛋白質結構變化和蛋白質的水合區域增加［18］，因此引起結合水和自由水受束縛程度減少，自由度增大；同時熱燙溫度對纖絲干酪的成熟過程影響很大，熱燙溫度越高，干酪中酶失活越嚴重，蛋白質水解過程越溫和，水合區域增加緩慢，結合水和自由水自由度上升較慢。不同大寫字母表示同行數值有顯著性差異（P＜0.05），不同小寫字母表示同列數值有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 不同熱燙溫度的纖絲干酪T21和T22隨貯藏時間的變化Table 1 Changes in T21and T22of string cheese with different stretching temperature under different storage

由表1還可以看出，不同熱燙溫度的纖絲干酪在貯藏10d過程中T21差異顯著；T22在貯藏7d前差異不顯著，貯藏10d后差異顯著，說明干酪在貯藏過程中熱燙溫度對結合水的影響程度高于自由水。這是因為熱燙溫度主要影響蛋白水解程度，揭示了結合水自由度的增加是由于蛋白水解引起的，自由水自由度的增加可能是由副酪蛋白纖維網絡擠占脂肪球和乳漿水空間，蛋白與乳清水接觸面積增加，水合作用增強引起的。

不同熱燙溫度的纖絲干酪質子強度A1和A2隨貯藏時間的變化見表2。質子強度A1和A2是表示樣品中弛豫時間分別在T21和T22范圍內的狀態水含水率的相對尺度。由表2可知，隨著貯藏時間的增加質子強度A1呈上升趨勢，質子強度A2呈下降趨勢，在纖絲干酪成熟10d后75 ℃樣品A1上升206.2%，A2下降38.1%；85 ℃樣品A1上升153.6%，A2下降32.3%；95℃樣品A1上升135.9%，A2下降30.1%，即水分遷移量大小依次為75 ℃樣品＞85 ℃樣品＞95 ℃樣品。說明纖絲干酪在貯藏過程中水分發生了遷移，從相對自由態向結合態的遷移過程，熱燙溫度越低水分遷移量越大。干酪在貯藏過程中蛋白質水解以及蛋白與脂肪漿液中的水分子水合作用增加，致使副酪蛋白纖維網絡可以容納更多的水分子，同時在脂肪漿液一側的化學勢比副酪蛋白纖維網絡一側化學勢高，膜兩邊化學勢的不平等引起的滲透作用是干酪內相對自由的水分向副酪蛋白纖維網絡內轉移的推動力，水分在纖絲干酪貯藏期間才可以遷移到副酪蛋白纖維網絡內，成為副酪蛋白纖維網絡的一部分［19］。熱燙溫度越高，蛋白質水解程度越低，水合區域面積下降，水合作用減弱，水分遷移量越低。

表2 不同熱燙溫度的纖絲干酪質子強度A1 和A2 隨貯藏時間的變化Table 2 Changes in A1and A2of string cheese with different stretching temperature under different storage

3 結束語

當熱燙溫度在75，85，95 ℃變化時能夠影響纖絲干酪貯藏過程中蛋白質水解程度以及蛋白質水合區域面積變化，因此纖絲干酪的持水力以及水分子的自由度和遷移量隨著熱燙溫度不同呈現不同特征。試驗結果表明，隨著貯藏期延長低熱燙溫度（75 ℃）的纖絲干酪的持水力高。利用低場核磁共振儀對纖絲干酪的自旋－自旋弛豫時間T2的測定，纖絲干酪中的水分分成兩部分，即結合水（T21）和自由水（T22），在干酪貯藏10d過程中結合水和自由水自由度增大，且自由度增加幅度大小依次為75 ℃樣品＞85 ℃樣品＞95 ℃樣品，同時纖絲干酪在貯藏過程中水分發生遷移，從相對自由態向結合態的遷移過程，水分遷移量大小依次為75 ℃樣品＞85 ℃樣品＞95 ℃樣品。

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