禽流感、新城疫血凝抑制試驗影響因素分析

蔣作強 貴池區動物疫病預防與控制中心 247000

車躍光 宿州市動物疫病預防與控制中心 234000

血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)由于能同時進行大量樣本分析,且因為具有試驗過程易于操作以及結果快速、準確等特點而成為我國各地動物防疫監督機構和養殖場進行流行病學調查、免疫程序制定及免疫效果監測等的主要手段之一。盡管此監測方法操作簡便、快捷、準確和實用,但是在實踐中由于某些因素的影響,也易導致試驗結果不準確,甚至無法判定。筆者根據多年的實踐操作將實驗中的影響因素淺析如下。

1 血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)中常見問題。

1.1 對照孔凝集。

1.2 全部凝集。

1.3 紅細胞全部下沉。

1.4 標準陽性對照血清的抗體效價與原結果誤差大于1個滴度。

1.5 淚滴狀流淌(完全血凝抑制)線細。

1.6 結果出現慢或結果出現快，并且整板無凝集現象。

1.7 凝集板出現跳孔現象。

1.8 凝集不明顯，無法判定結果。

2 問題產生的可能原因及應對措施

2.1 樣品方面

2.1.1 被檢血清腐敗變性。血樣采集后要馬上分離血清，分離后及時測定或放置在4℃冰箱內保存，力求新鮮。

2.1.2 受部分禽類血清中非特異性血凝抑制因子影響，尤其是水禽血清在做禽流感血凝抑制試驗時會出現對照孔和對照孔后2～3孔有凝集現象。因此，在利用血凝抑制試驗進行血清抗體測定之前，有必要對血清中非特異性因子進行排除。

2.2 試劑器材方面

2.2.1 緩沖液配制時間過長，pH值發生變化，使凝集不明顯。緩沖液（PBS）盡可能現配現用，濃度和酸堿度要準確，可用HCL和NAOH液調節酸堿度，并用pH試紙測試到pH值合適為止。如果用生理鹽水代替緩沖液，要使用新生產、新開瓶的生理鹽水。

2.2.2 4個血凝單位(HAU)抗原配制不準確。為防止4個HAU抗原配制不準確，在進行HI試驗前必須做4單位抗原校正。即在不加血清的情況下，第1～3孔的血球完全凝集，第4孔50%凝集呈點狀，說明4單位抗原的配制可以使用。否則，需重新測定抗原效價，重新配制4個HAU抗原，并做4單位抗原校正，直至結果準確。

2.2.3 紅細胞的來源。配制紅細胞懸液應采集2只以上成年公雞的血，一般要求用非免疫公雞，如果用免疫公雞代替，應增加洗滌次數和時間。

2.2.4 凝集板不干凈。目前，實驗單位和基層多使用一次性96孔V型板，要保持板面及凹孔的干凈。若使用玻璃材料的96孔凝集板，V型孔底需光滑明亮,對底部磨損嚴重的反應板要及時淘汰，使用后要按程序清洗干凈。

2.3 操作方面

2.3.1 在使用微量移液器時，液體加入量發生誤差。在使用微量移液器時，每個吸頭要安裝牢固，防止漏氣。操作時手壓下的力度要均勻。移液管嘴浸入液面下的深度要力求一致，不可過深，否則留在管嘴外的液體也滴入孔內，吸取量增大，對抗體滴度產生影響。

2.3.2 在稀釋血清時，產生氣泡。倍比稀釋血清時，在吸取第一孔時要先按下移液器，再插入凝集板孔，吸取后加入第二孔。在反復抽取過程中，移液器滴頭不要離開液面，防止產生氣泡，造成移液量不準。

2.3.3 樣品、抗原和紅細胞懸液在使用前沒有搖勻，加入時濃度高低不一，人為造成誤差。因此樣品、抗原和紅細胞使用前一定要搖勻，保證每一孔中加入的濃度準確一致。

2.3.4 移液器滴加液體時，有時會將管嘴與凝集板孔相接觸，造成污染。尤其是在加入紅細胞懸液時，孔內已有稀釋液、抗原、血清等，如果管嘴接觸到孔內混合液，會造成各個孔內液體相互污染。所以在使用移液器時，一定要保持加樣器管嘴與凝集板孔間的距離，以保證每個凝集孔內液體數量和濃度準確。

2.3.5 在凝集過程中振動凝集板。有些操作者在實驗過程中，急于想知道結果，將凝集板隨時取放，使凝集受到影響。因此在靜置過程中一定要有耐心，等時間到時再看結果，保證實驗的準確性。

2.3.6 抗原與抗體作用時間過長或過短對結果影響較大：過短出現凝集不完全，過長出現洗脫現象。

2.3.7 結果的判定。只有陰性、陽性對照均成立，將凝集板傾斜45度后，流淌呈線狀的孔數為血凝抑制效價。

2.3.8 出現重復加樣或漏加樣的情況。

2.4 實驗溫度

一般要求在室溫25℃～37℃的條件下進行實驗。當溫度過低，如低于15度時，出現結果就要慢，往往需要超過40分鐘才能出現清晰的結果。當實驗溫度低于4℃時紅細胞有時會發生自凝現象。當試驗過程中的環境溫度超過30℃時，試驗結果出現就快，往往在15分鐘左右就可讀數。一旦時間過長，結果就會消失，使整板無凝集現象。

3 做好試驗的幾個關鍵點

3.1 實驗人員責任心要強

在進行試驗操作時，由于受多方因素的影響，很容易出現錯誤，所以要求實驗人員在進行試驗時要嚴格操作，綜合考慮各方面的因素，正確判斷結果。當出現錯誤時要認真查找原因，及時總結，以免類似錯誤再犯。

3.2 紅細胞洗滌要充分

原則上，血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)所用的紅細胞應來源于SPF雞或非免疫的健康公雞，而實際上多使用免疫過的公雞。因此，對紅細胞的洗滌次數要多，要充分，并注意轉速和時間。至少洗滌5次，前4次為1500轉/分鐘，5分鐘；第5次為3000轉/分鐘，持續5～7分鐘。

3.3 4個血凝單位(HAU)抗原配制要準確

在試驗之前要對抗原用已知效價的標準陽性血清進行標定，以確定抗原的純度?？乖渲仆旰?，需對其進行標定，看是否達到所需標準?？乖r過高或過低對結果都有一定的影響。過高，測定抗體效價偏低；過低，測定效價過高，甚至很高。4個HAU抗原要現用現配，混懸液要混勻，配好的抗原在室溫下放置不得超過4小時。