寬口裂腹魚不同組織總RNA提取與質量分析

魏杰 張玲 馬振華 聶竹蘭 高澤霞

摘?要：本文采取寶生物公司RNAiso plus試劑從寬口裂腹魚肌肉、腦、腎臟、肝臟、腸、性腺、心臟中提取總RNA，分析了所提寬口裂腹魚不同組織總RNA的質量高低，及造成質量不同的具體原因，旨在為其他科研工作者在分析RNA質量時提供基礎理論依據。

關鍵詞：寬口裂腹魚?組織?總RNA

中圖分類號：Q52 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2012）10（a）-0019-03

寬口裂腹魚（Schizothorax eurystomus

（Kessler））屬鯉科、裂腹魚亞科、裂腹魚屬[1]，分布于新疆塔里木河水系阿克蘇河（庫馬力克河、托什干河、阿克蘇河）、渭干河（木扎提河、克孜爾河、渭干河、克孜爾水庫、東方紅水庫）、葉爾羌河（塔什庫爾干河、葉爾羌河、提孜那普河），是塔里木河水系的土著魚類[2]。隨著新疆水產業的發展，塔里木河土著魚類的研究項目呈上升趨勢，尤其在土著魚類基礎生物學方面，研究較多[3-5]。但對于土著魚類分子生物學方面，僅見于扁吻魚、塔里木裂腹魚及斑重唇魚線粒體DNA部分序列片段與基礎遺傳多樣性方面的研究[6-7]。而對于塔里木河土著魚類中寬口裂腹魚的分子生物學方面尚未見報道。

本實驗主要探討了寬口裂腹魚不同組織總RNA提取與質量，分析了不同組織所提RNA質量高低及其出現差異的原因。RNA分離提取是分子生物學研究的基本內容，也是功能基因組學研究技術的重要基礎。因此，寬口裂腹魚不同組織總RNA提取和純化的研究對于寬口裂腹魚cDNA文庫的構建，Northern雜交分析，定量PCR以及利用mRNA差異顯示技術篩選感興趣的相關基因等提供科技支撐。

1材料與方法

1.1材料

寬口裂腹魚由拜城縣漁民采用三層拉網于黑英山段黑孜爾河捕獲。平均體長17.8cm，暫養在玻璃缸內。

1.2玻璃器皿及塑料制品的處理

一次性塑料制品均在0.1%的DEPC水中

浸泡過夜，之后高壓蒸汽滅菌（121℃30min）。普通玻璃和金屬器皿于180℃干烤8h以上。用于RNA電泳的電泳槽先用去污劑洗干凈，雙蒸水沖洗，自然干燥后，用滅菌的0.1% DEPC浸泡24h。

1.3試劑

DEPC（焦碳酸二乙酯）、RNAiso Plus（寶生物公司（大連））、6×Loading buffer、氯仿、異丙醇、無水乙醇、EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）堿、冰醋酸。

1.4方法

準備工作：DEPC水（DEPC：ddH2O = 1：10000）浸泡所要使用的槍頭和EP管（1.5ml）過夜，然后經高壓滅菌后回收滅過菌的DEPC水①以制備1×TAE緩沖液；同時預留部分未浸泡過槍頭和EP管且稀釋過的DEPC水②，同樣滅菌后于-20℃保存以備溶解RNA。

（1）活體取樣，取0.1g左右寬口裂腹魚肌肉、腦、腎臟、肝臟、腸、性腺、心臟放入加有1ml的RNAiso Plus（寶生物公司（大連））的EP管，待所取樣本全部完成后再進行勻漿，整個實驗操作在冰浴上進行，以免RNA降解。

（2）將（1）中組織倒入已滅菌的5mL組織勻漿器中，同時加入0.6～1.0mL的RNAiso Plus和0.4～0.6mL的DEPC水，然后在冰上勻漿至無顆?；蛎黠@組織塊。

（3）將上述勻漿液裝入新的1.5mL EP管中（一般可裝兩管），冰上靜止5min左右，然后≥12000rpm，4℃離心5min。

（4）取上清液于新的1.5mL EP管中，每管取0.5mL即可，然后加入1/5 RNAiso Plus體積的氯仿，即0.4mL，加入氯仿后需立即用手劇烈振蕩15s以混勻。

（5）充分混勻后（無分相現象），≥12000rpm，4℃離心15min，即會分層：上層清液，中層為白色蛋白質，下層為帶鮮紅色的有機相。

（6）取0.6mL上清液于新的1.5mLEP管中，并加入等體積的異丙醇，然后充分混勻，冰上靜止10min，≥12000rpm，4℃離心10min。

（7）棄上清液，此時可見管底有白色沉淀，切勿將其傾倒，而后沿壁緩慢加入1.0mL經冷處理過75%乙醇（RNase-free），清洗沉淀，≥12000rpm，4℃離心5min。

（8）小心棄去乙醇，盡量除盡乙醇，然后室溫干燥5min左右，切莫離心或者加熱；加入20～50μl的RNase-free water（即DEPC水，上標為②）溶解，待完全溶解后-80℃保存。

（9）總RNA的濃度及純度測定

核酸蛋白測定儀：測定RNA溶液的吸光值，比較A260/A280的值，保證其在1.8～2.2為比較合適的值；同時測定其濃度（取1ul樣品于50μL滅菌的0.1%DEPC水中，再用biophotometer蛋白核酸測定儀測定A260及A280值。RNA純度按A260/A280之比值判斷；RNA濃度=樣品濃度×50μL）。

（10）瓊脂糖電泳檢測

所用瓊脂糖凝膠及電解液均用DEPC處理過的水配制（上標為①），電泳檢核糖體RNA的28s、18s和5.8s。

2結果與分析

2.1樣品的濃度與純度

經核酸蛋白測定儀測定：肝臟，心臟，肌肉2，肌肉的A260/A280值在1.8～2.2；肝臟、腦和腸的樣品濃度均較高，但是腦和腸A260/A280值小于1.8；心臟2和腎臟2的樣品濃度較低，A260/A280值亦小于1.8，具體見表1。

核酸蛋白測定儀260nm的讀數用于測定DNA或RNA的濃度，280nm的讀數用于測定DNA或RNA的純度[8-9]，由表1結果可知：

（1）肝臟，心臟，肌肉2，肌肉的樣品較純。

4個樣品以肝臟的濃度最高，可用后續的分子生物學實驗。肌肉2、肌肉與心臟的樣品濃度較低，出現這種結果的原因在于，肌肉組織相對于肝臟要堅韌，本次實驗勻漿時沒有充分研磨；若研磨時間過長RNA會降解，研磨時間不足，RNA提取量少。而心臟組織大小與魚體大小有關，魚體偏小，心臟亦小，在勻漿過程中，對于靜脈竇及動脈球部分難于磨碎，所以樣品濃度偏低。

（2）腦、腸的樣品濃度較高；心臟2和腎臟2的樣品濃度較低。

它們的A260/A280值均小于1.8，表示存在蛋白質的污染，這是由于實驗過程中用槍頭吸取水相的過程中，用力過大，將中間的蛋白層吸入，使蛋白質混入RNA提取液中。腦和腸需進一步純化才能用于后續分子生物學實驗。

2.2樣品總RNA1%瓊脂糖凝膠電泳

從泳道中的亮帶可以看出，本次電泳時間（20min）過長，其中的28s和18s有亮帶處rRNA的比率不是2：1[10]。泳道1（肌肉）、4（肝臟）、5（腦）、7（腸）、8（腦2）、9（肌肉2）和 10（心臟2）均可見三條清晰亮帶28S、18S和5S，但其中的28srRNA處的亮帶不是最亮，說明有部分RNA降解；在泳道4、5、8中5s處最亮，說明降解的較多。

泳道2（腎臟）則無亮帶，說明腎臟的RNA完全被降解，造成這種后果的原因有多種：①取樣時間過長，或者樣品保存不當，導致細胞組織壞死；②勻漿時間過長，空氣中的RNase進入勻漿管中，RNA降解；③勻漿不夠徹底，細胞未破碎，RNA無法從細胞中游離出來；④在加入氯仿后，未及時振蕩EP管中的樣品，使得DNA，RNA，蛋白質無法分開；具體原因有待進一步研究。

泳道3（性腺）在5s處有亮帶，而且很寬，18s和28s則完全看不見，說明這個電泳RNA完全降解了，全部降解成5S大小的片段，嚴重降解的片段往往是和5s大小近似。因此在跑電泳的時候，就會在5s處重疊。但是這個降解是提取操作不當而降解還是電泳過程中降解的，還需進一步探究。

泳道6（心臟）沒有出現28s，28srRNA降解為18srRNA。泳道11（腎臟2）在28s和18s處有亮帶，沒有出現5s，可能有DNA污染，或者是異丙醇沒有混合均勻導致，不會影響后續實驗。具體見圖1。

綜上分析：寬口裂腹魚不同組織RNA提取后經核酸蛋白測定儀檢測知：肝臟、心臟、肌肉和肌肉2，A260/A280在范圍1.8～2.0之間，說明樣品提取的比較純；但樣品腦，腸，心臟2和腎臟2的A260/A280均在1.8以下，表示受到蛋白質污染，需要純化樣品；心臟、肌肉和肌肉2的樣品濃度均較低，但是它們的A260/A280卻在1.8～2.0之間，說明樣品未受污染，只是某些組織中本來RNA含量就少，或研磨時間不足。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測知：肌肉、肝臟、腦、腸、腦2、肌肉2、心臟2都可以看見明顯的亮帶，說明樣品比較純，可以用于后續實驗；而腎臟和性腺的RNA完全降解則不能用于后續實驗。

綜合核酸蛋白測定儀與1%瓊脂糖檢測結果，本次采用RNAiso Plus試劑，在肝臟中所提取的總RNA質量高，效果好，可以用于進一步的cDNA文庫的構建，目的基因的克隆與表達，Northern雜交分析以及利用mRNA差異顯示技術篩選。

3結語

目前，RNA提取方法有多種，Chirgwin[11]等采用異硫氰酸胍/氯化銫法成功獲得收率和品質均較高的RNA，但該方法操作繁瑣。Feramisco[12]等介紹了硫氰酸胍/熱酚法獲得高質量RNA。Logemann[13]等采用氯化胍法分離了植物組織中的RNA。Cathala[14]采用氯化鋰/異硫氰酸胍法獲得了既有活性又較完整的RNA。謝保勝[10]、吳旭東[15]等采用異硫氰酸胍法提取了可用于后續實驗的斑馬魚和黃河鯰的總RNA，這兩個實驗在Chomczynski[16]等提出的一步法基礎上進行了優化，該方法該法與（異）硫氰酸胍/氯化銫法超速離心法相比，具有簡便、經濟和高效的特點，能同時迅速地處理多個標本，且RNA的完整性與純度均很高；但該法不適合從富含甘油三酯的脂肪組織中提取RNA，而且有時RNA會帶有多糖和蛋白多糖的污染，這些污染將影響乙醇沉淀后RNA的溶解，同時抑制RT-PCR反應，并通過結合到膜上而影響RNA雜交中的印跡步驟。

本課題組則采用大連寶生物公司的RNAiso Plus試劑對寬口裂腹魚不同組織總RNA提取量及其質量進行了初步分析。RNAiso Plus試劑采用劇烈的蛋白變性劑，能夠抑制RNA酶活性，還能有效地解離核蛋白與核酸的復合體，是獲得高純度RNA比較理想的方法[17]，但是在提取寬口裂腹魚總RNA時，質量并不高，主要原因在于：

（1）沒有RNA專用操作區，公共實驗室內實驗人員較多，來回走動，影響RNA提取質量。

（2）本次RNA提取時間是在夏季，天氣炎熱，實驗室內沒有空調極易受汗液污染。

（3）在勻漿器中加入RNAiso Plus試劑后，研磨時間短，細胞未破裂，導致心臟、肌肉和肌肉2等組織所提RNA量不足。

（4）加氯仿劇烈震蕩分層后，操作者在用移液器移取上清液時用力過大，吸入了中間有機相的蛋白質層，使腦，腸，心臟2和腎臟2等組織所提RNA受到蛋白質污染。

（5）電泳時間一般用8min，本次電泳時間過長（20min），造成RNA降解，使其中的28srRNA電泳條帶不呈最亮，28s和18s有亮帶處rRNA的比率亦不是2：1。

通過實驗，得出以下6點建議。

（1）要有RNA專用操作區，應保持清潔，并定期除菌；離心機、自動移液器、試劑等應專用。

（2）用于RNA實驗的玻璃器皿清潔后于180℃干熱滅菌8h；塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡過夜，經高壓蒸汽滅菌后于80℃烘箱中干燥。

（3）實驗過程中應戴一次性口罩和橡膠手套，并經常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及汗液中的RNase污染實驗器材。

（4）實驗人員避免說話或來回走動，以免唾液與空氣中的RNase污染。

（5）配制溶液用的酒精、異丙醇等均采用未開封的新瓶，溶液需用滅菌的DEPC水配制。

（6）DEPC（焦碳酸二乙酯）在提取RNA的過程中，可用來抑制RNase的活性。

參考文獻

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