銀杏葉提取物對缺氧狀態下牛視網膜血管內皮細胞增殖的影響

吳寧玲 吳沂旎 莊曾淵 郭曉勤

近年來研究發現血管內皮細胞是重要的內分泌細胞，可分泌多種活性物質參與血管舒展和緊縮調節的體液調節機制。視網膜血管內皮細胞（retina vascular endothelial cells，RVECs）為血－視網膜屏障的內屏障，RVECs損傷會導致血－視網膜屏障受損及血管舒展和緊縮調節的活性物質分泌紊亂，加快許多眼部疾?。ㄈ缣悄虿⌒砸暰W膜病變、黃斑變性、高度近視等）的發展，因此研究保護RVECs是防治這類疾病的新途徑。

銀杏葉，又名白果樹葉，為銀杏科植物銀杏樹的干燥葉?！侗静菥V目》記載其性味甘苦而澀，入肺、腎經。它有定喘、止咳、止帶濁、縮小便等作用。銀杏葉提取物（extract of ginkgo biloba，EGB）是采用現代提取技術從銀杏葉中提取的活性物質，其有效成分主要是黃酮甙類和萜內酯類化合物。銀杏葉提取物具有改善血液流變學狀況、抑制血小板聚集、抗氧化、清除自由基、緩解缺血缺氧及舒張血管平滑肌等有益作用。本文就EGB對缺氧狀態下RVECs增殖的影響進行了系統研究。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）牛視網膜血管內皮細胞（購自北京中日友好醫院臨床研究所）。（2）試劑和儀器：DMEM高糖培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美國 Gibco公司產品；胰酶、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞楓，美國 Sigma 公司產品；內皮細胞生長因子（endothelial cell growth factor，ECGF），購自北京中日友好醫院臨床研究所；銀杏葉提取物標準品（中國藥品生物制品產檢定所產品，批號：110866-200803）。 ELX808 酶標儀，美國 Bio-Tek公司產品；倒置顯微鏡，日本Olympus公司產品。

1.2 牛視網膜血管內皮細胞培養

將購買的牛視網膜血管內皮細胞復蘇，用含200 g/L FBS、100 mg/L ECGF、100mg/L 肝素以及 100×103U·L-1雙抗的DMEM完全培養基接種于20g·L-1明膠包被的培養瓶，置37℃、體積分數5%CO2孵箱培養。以后每4~5 d換液1次直至長成單層細胞。選第7代內皮細胞，0.1%胰蛋白酶消化備用。

1.3 實驗分組

實驗分為5組，即（1）空白對照組：無血清、無生長因子的DMEM培養液；（2）缺氧組：細胞對照組＋終濃度 1 mmol/ml CoCl2；（3）EGB 低濃度組：缺氧組＋0.001 μg/ml銀杏葉提取物；（4）EGB 中濃度組：缺氧組＋0.01 μg/ml銀杏葉提取物；（5）EGB 高濃度組：缺氧組＋0.1 μg/ml銀杏葉提取物。

1.4 MTT比色實驗檢測RVECs增殖情況

將血管內皮細胞以3×104個/ml濃度接種于96孔培養板中，每孔200 μl，每組設5個復孔，用含20%胎牛血清及100 μg/ml生長因子的培養基在37℃、5%CO2條件下培養24 h，根據上述實驗分組將CoCl2和含不同濃度EGB的培養基分別與RVECs繼續培養24 h及 48 h后，96孔板每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），繼續孵育 4 h，終止培養，小心吸棄孔內上清培養液，每孔再加入150 μl DMSO，打勻振蕩5 min，使結晶物充分溶解。選擇492 nm波長，在酶標儀上測定各孔光密度值。

1.5 統計學方法

采用統計軟件包SPSS for Windows（17.0版）統計軟件對計量資料進行方差分析，用Least-significant-difference（LSD）法進行兩兩比較。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察血管內皮細胞形態，內皮細胞復蘇后培養24 h，可見約30%～40%RVECs已貼壁，呈三角形或短梭形，排列不規則，核淡，胞膜明顯（圖 1），3～4 d后成片融合，細胞緊密排列，互不重疊，呈典型的鋪路卵石樣結構。傳代細胞約4～5 d能鋪滿培養瓶底。缺氧組的細胞貼壁率明顯減少，呈凋亡細胞形態學改變（圖2）。EGB組細胞貼壁率增加，凋亡細胞減少（圖3）。

2.2 不同濃度銀杏葉提取物對缺氧狀態下RVECs增殖的影響

EGB低、中、高濃度組各時間點的光密度值均高于缺氧組（P<0.05）。分組培養24 h，EGB高濃度組（0.1 μg/ml）的增殖活性最高；培養 48 h，EGB 中濃度組（0.01 μg/ml）的增殖活性最高，EGB 高濃度組的細胞增殖減緩（表1）。

3 討論

MTT可以將活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍紫色結晶物，使沉積在細胞中，通過使用DMSO溶解細胞中的藍紫色結晶物，并用自動酶標儀在492 nm波長處測定其吸光度值，即可間接反應活細胞數量。本實驗以體外培養牛視網膜血管內皮細胞為觀察對象，以MTT法檢測RVECs在不同濃度銀杏葉提取物作用下的增殖活性。

實驗性缺氧方法有2種，一種是在低氧環境中培養實驗細胞或組織，也稱為環境缺氧；另一種是在細胞或組織培養液中加入鐵的螯合劑或CoCl2，阻斷氧信號的轉導，在細胞中模擬低氧信號轉導，也稱為細胞缺氧。環境缺氧方法由于需要特殊的培養設備和低氧濃度的混合氣體，限制了其在實驗中的應用。Co2+是鐵螯合酶的底物，可以取代血紅蛋白卟啉環中的Fe2+，但是Co2+對氧的親和力較低，使血紅蛋白不能與氧結合，而保持還原構象，這樣就模擬了缺氧狀態。CoCl2的作用機理與低氧一致，相當于細胞氧感受器受到低氧刺激，本實驗采用CoCl2成功模擬了內皮細胞的缺氧環境〔1-2〕。

表1 MTT法測定各組牛視網膜血管內皮細胞的活性［D（492 nm），±s］

表1 MTT法測定各組牛視網膜血管內皮細胞的活性［D（492 nm），±s］

注：與缺氧組比較，①P＜0.05（方差分析，LSD 法）。 EGB：銀杏葉提取物

不同培養時間的光密度值24 h 48 h空白對照組 0.225±0.01① 0.257±0.01①缺氧組 0.193±0.01 0.184±0.01 EGB 低濃度組 0.001 0.214±0.02① 0.260±0.01①EGB 中濃度組 0.01 0.224±0.01① 0.283±0.02①EGB 高濃度組 0.1 0.230±0.02① 0.248±0.01①F值 61.79 29.22 P值 0.000 0.000組別 EGB質量濃度/（μg/ml）

國內外學者自20世紀60年代開始對銀杏葉的化學成分、藥理作用及臨床應用做了大量的研究工作。研究表明，銀杏葉提取物中含有的內酯成分能明顯地擴張血管，尤其是擴張微循環〔3〕。一項對正常受試者的對比研究發現，口服銀杏葉提取物可使眼動脈血流量增加 24%〔4〕。Kristinsson 等[5]的研究也發現，銀杏葉提取物可增加視網膜和脈絡膜的血液供應，并改善視功能。季梅等〔6〕研究證明銀杏黃酮具有抗氧化作用，通過保護血管內皮細胞，促進血管內皮細胞松弛因子的釋放而調節血管舒縮功能，擴張血管，增加缺血區血流量，從而改善視網膜末梢循環，以利阻塞血管再通〔7〕。因此目前銀杏葉提取物在眼科主要用于眼部缺血性疾病如視網膜靜脈阻塞、缺血性視神經病變、糖尿病視網膜病變等。

本實驗發現，24 h及48 h缺氧組的光密度值均低于細胞對照組，3個濃度銀杏葉提取物組光密度值均高于缺氧組（P<0.05），并且在一定濃度范圍內，隨著藥物濃度的增加而增加，說明銀杏葉提取物對缺氧狀態下視網膜血管內皮細胞存在劑量-效應關系，適宜濃度的銀杏葉提取物對缺氧狀態下的RVECs增殖呈明顯促進作用。

目前發現RVECs及神經節細胞耗氧量大，對缺血缺氧最敏感，如在糖尿病視網膜病變早期，RVECs及神經節細胞超微結構和分泌功能就發生改變，促使視網膜血管基底膜增厚、血管內外氧交換障礙，使視網膜內血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）增加，破壞血－視網膜屏障，誘導視網膜新生血管形成。有類似發病機制的眼病很多，其他如視網膜靜脈阻塞、黃斑變性、高度近視視網膜病變等。本研究提示銀杏葉提取物對RVECs有保護作用，也許在一定程度上能阻斷RVECs受損這一始動環節，從而減輕血－視網膜屏障的破壞，保持血管舒展和緊縮調節的活性物質的平衡，為治療這類疾病提供一個新的途徑。至于EGB對視網膜血管內皮細胞發揮保護作用的具體機理，尚有待進一步地研究。

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