黃芩體外抑菌作用的初步研究

王秋菊 楊建省 重慶市云陽縣畜牧獸醫局 404500

鴨疫里默氏桿菌病 （Riemerrela anatipestifer，RA）又稱鴨傳染性漿膜炎 （infectious serositis in duckings），是目前危害養鴨業最重要的傳染病之一[1]。目前國際上已經確定的血清型有21型，在美國以Ⅰ、Ⅱ、ⅹ為主，在對我國京、滬、川等地區的鴨疫里默氏桿菌的研究中發現，我國以Ⅰ和Ⅱ型為主[2]。鴨疫里默氏桿菌是主要侵害家鴨、火雞和鳥類的一種接觸性傳染病，主要侵害2-7周齡的雛鴨，呈急性或慢性敗血癥。臨床上主要表現為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟失調和頭頸震顫，少數慢性病例出現頭頸歪斜等癥狀。

目前藥物治療仍然是控制鴨疫里默氏桿菌病的首選方法，由于抗生素的濫用，使細菌菌株的耐藥性增強，很多藥物的療效降低。中草藥是天然性藥物，無毒、低殘留、不易產生抗藥性，因此引起了廣泛的關注。有研究表明，100%黃芩浸出液濾紙片對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌都有明顯的抑菌作用[3]。目前對RA感染治療的報道很多，但是對中藥治療的報道較少。為此，本文研究了黃芩對RA的生長及抗生素耐藥性的逆轉作用，探討黃芩的體外抗菌作用機理，為實際生產應用提供理論指導。

1 實驗材料和方法

1.1 主要儀器設備

高速臺式離心機（TGL-16B）：上海安亭科學儀器廠；

恒溫培養箱（GHX-90808-1）：上海?，攲嶒炘O備有限公司；

電子分析天平（AR1140/C）：上海奧豪斯公司；

旋轉蒸發儀（S2-93）：上海亞榮生化儀器廠；

超凈工作臺（SW-GJ-ZFD）：蘇州凈化設備有限公司。

1.2 主要試劑

黃芩、抗生素紙藥片、蛋白胨（Tryptone）、酵母粉（Yeast Extract）、瓊脂。

1.3 主要的菌株

鴨疫里默氏桿菌菌株：西南大學榮昌校區中獸醫實驗室保存。

1.4 藥液的制備

將黃芩粉碎，稱重后加入8倍蒸餾水浸泡后煎煮，30min/次，煎煮2次，合并兩次的煎煮液，離心去除掉液體里的藥物殘渣，用旋轉蒸發儀在75℃下蒸餾濃縮，濃縮后每毫升藥液含1g生藥。藥液分裝，高壓滅菌20min，置于4℃冰箱中備用。

1.5 黃芩對RA最低抑菌濃度（MIC）的測定

（1）菌液的制備

取RA菌種劃線接種于普通瓊脂平板，37℃過夜培養，革蘭氏染色鏡檢合格后，挑去單個菌落接種于5mL肉湯培養基，于37℃震蕩培養至對數生長期，用滅菌的肉湯培養基稀釋調整濃度在1×103CFU/mL。

(2)最低抑菌濃度的測定

采用5倍稀釋法測定。取8支滅菌的試管，無菌濃度下分別加入濃度為1×103CFU/mL的菌液4mL/支，分別編號 1，2，3，4，5，6，7，8；取 1mL 藥液加入第1號滅菌的試管，混勻，然后吸取1mL加入到第2支試管，如此依次稀釋到第7支試管，第8支試管不加藥液作為對照；另取一支試管做不加菌液只有藥物的對照。37℃下震蕩培養過夜，觀察細菌生長情況，并測定培養前與培養后OD600值，以與對照組無顯著差異管的最高稀釋度作為黃芩對RA的MIC。

1.6 黃芩對RA耐藥性的逆轉作用

按1：100的比例將一定量的RA純培養物接種于5mL濃度為0.3MIC的普通肉湯培養基中，37℃、170rpm/min下震蕩培養過夜，記為第1代。再將第1代培養物按1：100的比例接種于5 mL濃度為0.3MIC的普通肉湯培養基中，37℃、180rpm/min下震蕩培養過夜，記為第2代。按照此方法連續培養至20代，并注意觀察細菌的生長情況。取第20代培養物，采用1.5方法測定黃芩的最低抑菌濃度，比較與原代之間的差別，同時設立不含黃芩藥液的空白對照和pH值與試驗組一致的陰性對照。

1.7 黃芩對RA抗生素耐受性的逆轉作用

取1.6RA原代和第20代純培養物，采用藥敏紙片法，測定對四環素 （Tetracucline）、卡那霉素（Kalamycin）、 強力霉素 （Doxycycline）、 新霉素（Neomycin）、 阿 莫西林 （Amoxicillin）、 鏈 霉 素（Streptomycin）、環丙沙星（Ciprofloxacin）和氟哌酸（Norfloxacin）的敏感性，測定抑菌圈大小，比較兩代培養物之間的差異。

表1：黃芩對RA菌株的最低抑菌濃度

2 實驗結果與分析

2.1 黃芩對RA菌株最低抑菌濃度的測定

用5倍稀釋法測定梯度稀釋，測定黃芩對RA菌株的最低抑菌濃度。菌液初始濃度為1×103CFU/mL，以與對照組無明顯差異管的最高稀釋度作為黃芩對RA的MIC。試驗結果顯示,黃芩對RA菌株的MIC為1.6mg/mL,見表1。

2.2 黃芩對RA的耐藥性誘導作用

將RA在含有0.3MIC藥物濃度的培養基中連續傳代20代，測定黃芩對RA第20代的MIC，結果見表2。實驗結果表明：黃芩濃度為1.6mg/mL時，RA生長情況與空白對照組的差異很小，即黃芩對第20代RA的MIC為1.6mg/mL。

表2：黃芩對RA菌株耐藥性的誘導作用

2.3 黃芩對RA抗生素耐受性的逆轉作用

將RA在含有0.3MIC藥物濃度的培養基中連續傳代20代，采用藥敏制片法分別測定原代和第20代純培養物對抗生素的敏感性，經游標卡尺測定抑菌圈的大小，兩代次的比較結果見表3。研究結果顯示：RA對四環素、卡那霉素、環丙沙星的敏感性并未發生顯著的變化，對強力霉素、阿莫西林、鏈霉素、新霉素、氟哌酸的敏感性發生了顯著性的變化。研究結果表明，經過傳代后的RA對抗菌藥物的敏感性增強。

3 分析與討論

3.1 黃芩對RA菌株的耐藥性誘導作用

研究發現，RA在含有低濃度黃芩的培養基中連續傳代后，MIC無變化，說明RA對黃芩不容易產生耐藥性。

3.2 黃芩對RA抗生素耐受性逆轉作用

本研究發現，將RA在含有0.3MIC藥物濃度的培養基中連續傳代20代，采用藥敏制片法分別測定原代和第20代純培養物對抗生素的敏感性，結果顯示：RA對四環素、卡那霉素、環丙沙星的敏感性并未發生顯著的變化，對強力霉素、阿莫西林、鏈霉素、新霉素、氟哌酸的敏感性發生了顯著性的變化。研究結果表明，經過傳代后的RA對抗菌藥物的敏感性增強。病原菌對抗生素產生耐受性主要是通過基因水平或者是蛋白質水平實現的，而重要對病原菌抗生素耐受性的逆轉作用也就是通過這兩個水平實現的，且對不同藥物耐受性的逆轉作用強度不同。重要對病原菌抗生素耐受性產生逆轉作用的可能機制主要包括：

表3：黃芩對RA菌株抗生素耐受性的逆轉作用

（1）破壞RA菌體細胞的莢膜多糖成分，藥物與細菌發生直接接觸，從而使菌體細胞對黃芩的敏感性增強；（2）一直細菌DNA、RNA、蛋白質的生物合成或者阻斷菌體細胞的訊號通路，影響RA菌體細胞的正常生理活動。本研究中RA經連續傳代后對部分抗生素的敏感性增強，其確切的原因有待進一步的深入研究。

[1]卡爾尼克BW（高福,劉文軍主譯）.禽病學（第九版）[M].北京：北京農業大學出版社,1991.

[2]陸承平.獸醫微生物學[M].北京:中國農業出版社.

[3]劉云波,郭立華,邱世翠,等.黃芩體外抑菌作用研究[J],時珍國醫國藥.2002,13(10):596.