神經肽類似物DOTA－Substance P的177Lu標記及其生物分布

梁積新，李洪玉，向學琴，羅洪義，胡連生，鄧新榮，陳 陽，莊 玲，羅志福

（1.中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.核工業北京401醫院 核醫學科，北京 102413）

Substance P（P物質，以下簡稱SP）是一種含有11個氨基酸的神經肽，其氨基酸序列為：Arg－Pro－Lys－Pro－Gln－Gln－Phe－Phe－Gly－Leu－Met－NH2。SP主要分布于中樞神經系統和消化道內，心血管中亦有廣泛分布。當神經受刺激后，SP可在中樞端和外周端末梢釋放，與神經激肽－1（NK－1）受體結合發揮生理作用。它對多種生理活動有促進作用，除作為神經遞質、神經調節和內分泌或旁分泌因子起作用外，還可能參與其他生理過程［1］。

177Lu是一種核性質較為理想，可用于腫瘤放射性治療的放射性核素。177Lu的半衰期為6.7d，發射的β－粒子的平均能量為133keV，在組織中平均射程為670μm，適合殺死腫瘤組織，除β－射線外，還發射能量為113keV和208keV的γ射線，可用于顯像監測和指導治療過程，起到“一藥兩用”的作用［2－3］。

胰腺癌屬于神經內分泌瘤，是致死率高的一類腫瘤，其五年存活期僅為3%～5%。石欣等［4］研究發現，胰腺癌組織中NK－1受體蛋白有過度表達。利用SP與NK－1的親和性，將放射性核素引入SP分子中，利用SPECT技術可以對胰腺腫瘤進行顯像，獲取腫瘤定位、大小等信息，對腫瘤治療方案的制定提供參考［5］。

Pujatti等［6］對177Lu－DOTA－SP 在 胰 腺 癌AR42J模型裸鼠中的生物行為進行了初探，發現該藥物在AR42J胰腺癌細胞中有一定的攝取。

本研究旨在建立177Lu標記神經肽類似物DOTA－SP的方法以及177Lu－DOTA－SP的質控分析方法，并進行標記物在正常小鼠與PANC－1模型裸鼠體內的生物學行為研究，探討177Lu－DOTA－SP用于人胰腺癌PANC－1的腫瘤顯像及放射性治療的可能性。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑與儀器

DOTA－SP：IAEA 提供，純度大于95%；177LuCl3溶液：以富集176Lu2O3（豐度為82.8%）為靶材，在中國原子能科學研究院49－2反應堆內輻照，經化學處理后得到，放射性比活度88.8～111.0TBq／g（2.4～3.0Ci／mg）；乙腈：色譜純，比利時Acros公司產品；三氟乙酸（TFA）：生化級，比利時Acros公司產品；ITLCSG：Gelman Sciences公司產品。其他試劑均為國產分析純，實驗用水為MilliQ水。

HPLC系統：美國Varian公司；HPLC放射性檢測器：德國Raytest公司；BS124S電子天平：德國Sartorius公司；N2－522E.CAM 雙探頭SPECT：德國西門子公司；FH463A自動定標器、FT－603 型閃爍探頭：北京核儀器廠；CRC15R放射性活度計：美國Capintec公司；Mili－Q超純水系統：美國Millipore公司。

1.2 實驗動物

昆明種小白鼠：雌性，28只，20±2g，清潔級，購于中國醫學科學院實驗動物研究所。

PANC－1人胰腺癌裸鼠：12只，購于協和醫科大學動物中心。采用瘤塊接種方式，將PANC－1人胰腺癌腫瘤組織移植到Balb／c－nu裸鼠的右前腿皮下，將種植了腫瘤的裸鼠正常飼養兩周，腫瘤直徑長至約1cm時用于模型裸鼠的體內分布和SPECT顯像實驗。

2 實驗方法

2.1 DOTA－SP的177Lu標記

取0.1mL DOTA－SP水溶液 （含 DOTASP 20～30μg）加入干凈Eppendorf管中，再加入0.1mL 0.4mol／L醋酸鈉－龍膽酸緩沖溶液和0.1mL177LuCl3溶液（放射性活度約為185MBq）。用1mol／L NaOH 溶液調 pH 約4.5，搖勻，于90℃下反應30min。

2.2 177Lu－DOTA－SP的質控分析

177Lu－DOTA－SP的標記率和放化純度采用快速薄層層析法（ITLC）和高效液相分析法（HPLC）進行分析。ITLC的分析條件為：ITLC－SG為支持體，0.1mol／L檸檬酸鈉溶液為展開劑。HPLC色譜條件為：C18色譜柱（Hypersil ODS2，φ4.6mm×250mm）；紫外檢測器，波長220nm；流速為1mL／min；溶劑 A為0.1%TFA的水溶液，溶劑B為0.1%TFA的乙腈溶液。采用梯度洗脫：0～3min 0%溶劑B，3～25min 0～90% 溶劑B，25～30min 90%溶劑B，30～35min 90%～0溶劑B。

2.3 標記物的純化

采用Sep－Pak固相萃取法純化標記產物：將反應液加載到分別用甲醇和水預活化過的C18 Sep－Pak柱上，先用10mL水將游離的177LuCl3洗脫，再用3～5mL甲醇將177Lu－DOTA－SP洗脫下來并收集，用N2吹干，用適量體積的生理鹽水溶解，備用。

2.4 177Lu－DOTA－SP的體外穩定性研究

2.4.1 生理鹽水中的穩定性 將2.3節所得177Lu－DOTA－SP的生理鹽水溶液于室溫下放置，并于不同時間間隔取樣，用ITLC層析法和HPLC色譜法確定其放化純度，分析條件與2.2節相同。

2.4.2 小牛血清中的穩定性 取0.1mL2.3節所得177Lu－DOTA－SP溶液，加入0.9mL 5%或10%小牛血清中，混勻，于37℃下溫育。分別于30min，1、2、3、4h取0.1mL混合液，加0.1mL乙腈溶液，渦旋混勻，離心，取上清液，用ITLC層析法和HPLC色譜法確定其放化純度，分析條件與2.2節相同。

2.5 177Lu－DOTA－SP 在正常小鼠體內的生物分布

取28只昆明種雌性小白鼠，隨機分為7組，每組4只，經尾靜脈注射0.1mL純化后的177Lu－DOTA－SP（0.37MBq），分別于給藥后15、30min，1、2、4、24、48h斷頭處死，取血、心、肝、脾、腎、肺、胃等臟器稱重，并測定放射性計數，計算每克組織的放射性攝取率（%ID／g）。

2.6 177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌 PANC－1模型裸鼠體內的生物分布及SPECT顯像

PANC－1人胰腺癌模型裸鼠9只，隨機分為3組，每組3只，經尾靜脈注射0.1mL177Lu－DOTA－SP（0.26MBq）溶液，于給藥后1、2、4h斷頭處死，取腫瘤、血、心、肝、脾、腎、肺、胃以及其他感興趣臟器稱重，測定放射性計數，計算每克組織的放射性攝取率（%ID／g）。

用于SPECT顯像的模型動物裸鼠3只，每只 尾 靜 脈 注 射 0.1mL177Lu－DOTA－SP（1.11MBq），分別在給藥后30、60、90、120min進行顯像。

顯像時，177Lu能窗采用113keV，顯像數據在計算機系統256×256矩陣中進行記錄與分析。放大倍數為1，每只動物采集放射性計數為35 000。

3 實驗結果與討論

3.1 177Lu－DOTA－SP的制備

以DOTA為雙功能螯合劑，實現了放射性治療核素177Lu對神經肽類似物小分子肽SP的標記。在優化條件下（DOTA－SP用量為20～30μg，pH＝4.5，90 ℃ 下反應30min），DOTA－SP的177Lu標記率＞90%。SP為具有生物活性的小分子肽，其標記通常需要高比活度放射性核素［7］，為了避免在標記過程帶入其他金屬的污染，在操作過程中，一定小心避免引入金屬雜質。通常說來，DOTA是一種絡合能力很強的雙功能螯合劑。然而，標記率僅為90%，可能的原因是177Lu放射性比活度不夠高，大量載體176Lu 與 DOTA－SP 競 爭 結 合，從 而 影 響DOTA－SP的177Lu標記率。

在上述ITLC 分析體系中，177Lu－DOTA－SP停留在原點，其Rf為0.0～0.1，177LuCl3則隨溶劑移到前沿，其Rf為0.9～1.0。

177Lu－DOTA－SP的HPLC分析圖譜示于圖1。由圖1可以看出，177Lu－DOTA－SP的保留時間為（17.6±0.1）min，而游離177LuCl3的保留時間為（4.6±0.1）min。

經 Sep－Pak 柱 固 相 萃 取 純 化 后，177Lu－DOTA－SP的放化純度＞98%。

圖1 177Lu－DOTA－SP的HPLC圖譜

3.2 177Lu－DOTA－SP的體外穩定性

177Lu－DOTA－SP的體外穩定性分別示于圖2和圖3。圖2結果顯示，177Lu－DOTA－SP在生理鹽水中有良好的穩定性，于室溫下放置9d，標記物放化純度仍大于95%。圖3結果顯示，177Lu－DOTA－SP在5%小牛血清中有較好的穩定性，溫育2h后，其放化純度仍尚大于95%，溫育4h后，下降到92.3%；177Lu－DOTA－SP與濃度較高的血清（10%）競爭反應時，其降解稍快，溫育4h后，放化純度下降到84.9%。

圖2 177Lu－DOTA－SP在生理鹽水中的穩定性

圖3 177Lu－DOTA－SP在小牛血清中的穩定性◆——5%血清；■——10%血清

3.3 177Lu－DOTA－SP的體內生物分布

177Lu－DOTA－SP在正常小鼠體內的生物分布結果列于表1。由表1可知，177Lu－DOTA－SP在正常小鼠的體內生物分布呈以下特點：標記物血清除快，在給藥15min時，血中放射性攝取為（4.63±0.80）%ID／g，而在給藥2h時，降為（0.80±0.12）%ID／g；腎放射性攝取高，在給藥2h后腎攝取達到峰值，為（37.24±3.73）%ID／g，且滯留時間長，給藥48h后，仍高達（15.02±4.97）%ID／g，提示標記物在體內的代謝途徑主要是腎臟。標記物在骨骼中有一定放射性攝取，且滯留時間長，這與游離177Lu的親骨性有關。

表1 177Lu－DOTA－SP在正常小鼠體內的生物分布（±s，n＝4）

表1 177Lu－DOTA－SP在正常小鼠體內的生物分布（±s，n＝4）

組織或器官放射性攝取率／（%ID·g－1）15min 30min 1h 2h心2.14±0.29 1.78±0.38 1.08±0.05 0.97±0.09肝 2.20±0.13 3.02±0.42 2.99±0.12 2.99±0.47脾 1.64±0.15 2.72±0.63 2.09±0.25 2.45±0.94肺 3.69±0.97 3.51±0.50 2.11±0.30 1.19±0.06腎 20.41±3.03 33.89±4.23 33.95±1.91 37.24±3.73血 4.63±0.80 3.71±0.85 1.39±0.21 0.80±0.12胰腺 1.93±0.31 1.91±0.81 1.11±0.07 0.72±0.08胃 2.64±0.52 2.84±0.84 1.88±0.18 1.36±0.26腸 4.08±0.70 3.34±1.48 2.44±0.93 1.80±0.18股骨 3.17±0.22 3.92±0.76 3.30±0.21 3.13±0.29肌肉 1.30±0.14 1.21±0.28 0.56±0.04 0.49±0.05組織或器官放射性攝取率／（%ID·g－1）4h 24h 48h心0.82±0.06 0.71±0.10 0.66±0.02肝 3.08±0.17 2.21±0.16 1.47±0.65脾 2.40±1.02 1.67±0.18 1.30±0.39肺 1.12±0.37 0.60±0.16 0.56±0.28腎 33.32±2.56 27.83±3.30 15.02±4.97血 0.51±0.05 0.20±0.02 0.18±0.06胰腺 0.79±0.10 0.59±0.05 0.58±0.07胃 1.09±0.18 0.81±0.04 0.70±0.13腸 1.83±0.57 1.34±0.18 0.82±0.39股骨 3.19±0.41 3.08±0.38 2.65±0.54肌肉0.50±0.08 0.34±0.05 0.33±0.06

3.4 177Lu－DOTA－SP 在人胰腺癌 PANC－1模型裸鼠的體內分布

177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌 PANC－1模型裸鼠體內的生物分布列于表2。

表2 177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌PANC－1模型裸鼠體內的生物分布（±s，n＝3）

表2 177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌PANC－1模型裸鼠體內的生物分布（±s，n＝3）

組織或器官放射性攝取率（%ID·g－1）1h 2h 4h心1.01±0.09 0.77±0.10 0.80±0.03肝 0.66±0.15 0.56±0.01 0.38±0.24脾 1.56±0.61 1.20±0.16 1.14±0.25肺 1.13±0.06 0.63±0.19 0.70±0.18腎 4.89±1.09 4.05±0.15 3.07±1.97胰腺 0.80±0.06 0.58±0.03 0.78±0.21胃壁 1.96±0.09 1.25±0.24 1.03±0.34小腸 5.20±0.89 3.61±0.80 2.14±1.68肌肉 0.66±0.10 0.46±0.12 0.51±0.11股骨 2.18±0.44 1.74±0.16 2.39±0.73血 0.67±0.16 0.28±0.06 0.27±0.11腫瘤3.34±1.67 1.76±0.36 1.35±0.63

由表2可知，給藥1h時，177Lu－DOTA－SP在腫瘤中有相當高的放射性攝取，為（3.34±1.67）%ID／g，在給藥后4h，腫瘤中仍有一定放射性攝取，為（1.35±0.63）%ID／g。人胰腺癌PANC－1中放射性攝取在給藥后不同時間點均高于正常胰腺細胞中的放射性攝取，提示在PANC－1腫瘤細胞中存在NK－1受體。

177Lu－DOTA－SP在人胰腺癌模型裸鼠中的SPECT圖像采集選取了4個不同時間點（0.5、1、1.5、2h）。其中0.5和1h時的SPECT圖像示于圖4。由圖4可以看出，177Lu－DOTA－SP在PANC－1人胰腺癌中并沒有明顯濃集?？赡艿脑蚴?，對于放射性金屬核素標記的多肽類藥物來說，放射性核素的比活度是影響藥物體內代謝性質的重要因素［8］。由于本實驗中用于177Lu－DOTA－SP制備的177Lu 的比活度不夠 高，載體176Lu的大量存在影響到177Lu－DOTA－SP 的體內性質，從而也影響腫瘤對藥物的攝?。?］。

圖4 177Lu－DOTA－SP在PANC－1人胰腺癌模型裸鼠中的SPECT顯像

4 結 論

采用177Lu標記神經肽類似物DOTA－SP的標記方法簡單，標記物177Lu－DOTA－SP顯示了良好的體外穩定性。177Lu－DOTA－SP 在血液中清除快；腎中放射性攝取高，提示標記物在體內的排泄途徑主要是泌尿系統。體外穩定性和體內生物學分布特點顯示了177Lu－DOTA－SP良好的 藥 物 性 質。177Lu－DOTA－SP 在 人 胰 腺 癌PANC－1模型小鼠體內的生物分布結果顯示，腫瘤對標記物有一定攝取，然而，SPECT顯像結果顯示，177Lu－DOTA－SP 在 PANC－1人胰腺癌腫瘤中無明 顯 濃 集。177Lu－DOTA－SP 能 否 應 用于胰腺癌腫瘤顯像與治療尚需進一步研究。

致謝：對鄭德強和孫桂全同志在實驗中提供的幫助表示衷心感謝！

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