中國傳統醬油生產用米曲霉菌種研究進展

紀鳳娣， 魯 緋， 程永強

(1．北京一輕研究院食品與工業研究所，北京 101111;2．中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

中國傳統醬油生產用米曲霉菌種研究進展

紀鳳娣1， 魯 緋1， 程永強2

(1．北京一輕研究院食品與工業研究所，北京 101111;2．中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

米曲霉是我國傳統醬油生產用關鍵菌種．關于米曲霉菌株選育的研究主要包括，高產蛋白酶菌株選育技術研究、酶學特性研究、產酶影響因素研究等方面．高產蛋白酶菌株的選育為研究重點．雖然，研究均顯示經過改良的菌株性能超過了原始出發菌株，但是成果仍然局限于實驗室理論分析．我國科研人員仍需努力，加強對米曲霉菌株在工業化生產中實際應用效果的研究．

醬油;米曲霉;選育;酶學特性;基因

米曲霉(Aspergillus oryzae)是我國傳統發酵調味食品—醬油釀造用關鍵菌種．目前，我國80%以上的醬油生產企業，均采用米曲霉制曲，為后續發酵過程提供所需的各種酶系，如蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等．醬油的品質、生產效益等與釀造醬油用的米曲霉有十分密切的關系，因此，本文對我國醬油生產用米曲霉菌種的研究現狀進行概述，為企業醬油產品質量的提高及工藝控制提供依據．

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一種好氣性真菌，屬于半知菌亞門、曲霉屬，菌絲一般呈黃綠色，后為黃褐色，分生孢子梗生長在厚壁的足細胞上，分生孢子頭呈放射形、項囊球形或瓶形，小梗一般為單層，分生孢子球形平滑，少數有刺，適宜的培養溫度為37℃．米曲霉的菌絲由多細胞組成，是一類產復合酶的菌株．目前，我國醬油生產絕大多數采用滬釀3.042米曲霉制曲，其具有對營養要求較粗放、生長快、蛋白酶活力較高、產孢子量大、不產毒素等特點．已有研究表明［1－2］，在現有制曲條件下，其所產蛋白酶以中性和堿性蛋白酶為主，其他酶系不足，導致原料中各種成分如淀粉質原料不能完全被分解，風味不足．選育醬油釀造用新菌株，一直以來都是國內科研工作的熱點．

1 米曲霉菌株篩選研究

通過各種方式誘變(紫外線、離子注入法、原生質體融合、微波)獲得性能優良的菌株是普遍采用的方法．早在30多年前，科學工作者就對米曲霉滬釀3.042進行了純化復壯，挑選出蛋白酶活力高、生長快、易管理、原料利用率高的菌種，但這仍無法滿足醬油生產發展的需要．

1.1 物理、化學誘變研究

大量科研人員對高產蛋白酶米曲霉菌株篩選進行了研究．有研究采用紫外線、氯化鋰和硫酸二乙脂(DES)復合誘變方法，以米曲霉M-2為出發菌株，篩選得到酸性蛋白酶高產突變株［3］．利用紫外線、高溫、亞硝酸單獨或復合處理，以米曲霉A.oryzae-I為出發菌株，得到的突變株蛋白酶活力比原始菌株提高了33.12%［4］．以自選米曲霉為出發菌株，采用紫外線誘變篩選出的突變株蛋白酶活力提高了1.47倍［5］．以米曲霉l-7.3為出發菌株，通過紫外誘變，結合含有不同制霉菌素藥物濃度的PDA培養基，得到了酸性蛋白酶和中性蛋白酶活分別提高了230.10和17.5%的突變株［6］．以醬油釀造用菌粉為出發菌，經紫外線誘變及控溫培養處理后，獲得遺傳穩定性較好的變異菌株，酶活力提高了77.84%［7］．以滬釀3.042為出發菌株經過快中子、鈷60、Y射線、紫外線、甲基磺酸乙酯(EMS)、氯化鋰等交替誘變育種，篩選出新菌株UE336-2米曲霉．其應用于生產種曲孢子數可達5×109個/g以上，接種量0.4% ～0.5%，成曲中性蛋白酶活力比對照菌提高70% ～100%，其他酶系相仿［8］．利用紫外線誘變篩選出高產纖維素酶米曲霉菌株，突變株纖維素酶活力是原始株的1.84倍［9］．以野生米曲霉K61進行紫外誘變，篩選出蛋白酶活力高且遺傳性能穩定的突變株Y29，性能優越的米曲霉滬釀3.042菌株［10］．以滬釀3.042為出發菌株，經紫外誘變與化學誘變，篩選得到變異菌株蛋白酶活性比原菌株提高了110%，耐溫性能較強，遺傳穩定性較好［11］．

1.2 新技術應用篩選研究

采用傳統的物理、化學方法篩選菌株，勞動量巨大，誘變率低．隨著新的誘變技術的產生，顯著提高了菌株的誘變率．有報道以滬釀3.042米曲霉原生質體制備，利用經過分生孢子的原生質體紫外線－氯化鋰、NTG復合誘變得到 8株突變株［12］．潘力等［13］利用原生質體，進行多親株雙滅活PEG介導融合，獲得一株融合菌株FII4l，酶活力比出發株提高1.76倍，且遺傳穩定．王華等［14］采用高壓誘變技術對米曲霉菌株進行處理，得到了蛋白酶及淀粉酶活性顯著提高的菌株．

雖然對醬油生產用微生物米曲霉進行誘變選育的研究報道眾多，并且大都獲得了性能優良的新菌株，但是，目前并沒有應用于生產獲得成功的報道．

2 提高米曲霉酶活的影響因素研究

碳源、氮源、初始pH值及溫度等均能影響米曲霉所產酶系及酶活．胡學智等［15］發現無機氮、拌水率、無機鹽均能促進米曲霉3.042產酶，提高大豆蛋白的消化率．楊世平等［16］則得到麩皮:豆粕粉=4∶1，水的質量分數為60%，最佳培養溫度為30℃，最佳培養時間為48 h為產中性蛋白酶的適宜培養條件．鄧靖等［17］研究表明麩皮∶葡萄糖∶水 =9∶1∶5，接種3 mL孢子菌懸液，28℃培養72 h時酶活最高．李秀婷等［18］研究認為產酶的最佳碳、氮源分別為麩皮及蛋白胨，最適初始pH值為6.0～8.0，溫度為30℃．劉曉蓉等［19］研究結果表明，豆粕含量20%，NaCl濃度2%，初始pH6.6，接種量3‰，31℃培養108 h，淀粉酶活最大．張艷芳等［20］用米曲霉40188制曲最佳時間為50～72 h，中性蛋白酶及a-淀粉酶最高．林祖申［8］篩選出新菌株UE336-2米曲霉，28 h制曲釀制醬油全氮利用率平均提高7.1%．傅力等［21］報道米曲霉菌株UF366最適的制曲培養基為豆粕∶麩皮∶水 =6∶4∶5，培養溫度 33 ℃，培養時間32 h，翻曲2次，接種量4‰可得到最高的蛋白酶活．

3 菌株蛋白酶、淀粉酶酶學特性研究

醬油的產生是在各種酶系的作用下將原料中的蛋白質、淀粉、纖維素等成分降解而形成．因此，醬油的品質與釀造醬油用米曲霉所產酶系的性質有十分密切的關系．

3.1 蛋白酶學特性研究

醬油生產中最注重原料利用率的高低，因此，蛋白酶活性高是米曲霉菌株必須具備的一個重要特性．一直以來，中性蛋白酶活作為一個重要指標用于指導生產，但是，研究發現，酸性蛋白酶對原料中蛋白質的降解及風味的形成也發揮著重要的作用．近年來，對于米曲霉菌株所產蛋白酶酶學特性的研究開始活躍，隨著對不同菌株酶學特性研究的深入，為指導實際生產提供了有力的支持．

黨敏娜等［22］研究發現食鹽對不同米曲霉菌株所產中性蛋白酶活力的影響不同，在實際醬油發酵中的鹽濃度下測定中性蛋白酶活力才能更客觀、準確地反映菌種最適合生產實際使用．湯鳴強等［23］研究表明，米曲霉F-81產中性蛋白酶最適作用溫度為60℃，Cu2+、Fe3+強烈抑制酶活性．張淑娟等［24］分析發現米曲霉令野菌株產蛋白酶最適溫度為40℃，40℃保溫5 h，剩余酶活力為54%，NaCl對其有非競爭性抑制作用．李艷麗等［25］發現米曲霉ZW-06產中性蛋白酶，最適溫度45℃，最適作用pH為6.5和9.0，Mg2+，Mn2+和 Ca2+對蛋白酶有強烈的激活作用，Fe2+和Cu2+有強烈抑制作用．林祖申［8］對米曲霉菌株UE336-2所產蛋白酶研究表明，最適pH值為6～9，最適溫度50℃，但失活較快，在含有食鹽7%左右、溫度40℃ ～45℃為宜．米曲霉40188產中性蛋白酶，最適pH分別為7～8，中性蛋白酶酶活隨著鹽濃度的增加呈下降趨勢［20］．最近，研究發現［26－27］，醬油成曲中含有不同分子量大小的蛋白酶，分別作用于蛋白質的不同位點，這一發現，為更具有針對性地提高醬油生產技術，提供了理論支持．

3.2 淀粉酶酶學特性研究

近年來，人們開始意識到淀粉酶對醬油風味的形成有重要貢獻，有研究指出醬油成曲中至少有4種不同分子量的淀粉酶組分，其中活性最高的淀粉酶組分分子質量是52 000 u，為a-淀粉酶，最適pH值6.2，最適溫度為 50 ℃［28］．劉曉蓉等［19］對米曲霉1228產a-淀粉酶研究發現，該酶最適溫度為55℃，最適pH 值為 5.0，Ca2+對酶有激活作用，Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+和Cu2+對其有不同程度的抑制．張艷芳等［20］對米曲霉40188產a-淀粉酶的研究表明，最適pH 6～8，酶活在40℃穩定，熱穩定性較強，耐鹽性較強．

4 結束語

新技術的不斷涌現，為我們獲得性能優良的菌株提供了越來越有力的支撐，雖然，已有研究獲得了很多性能優良的新菌株，遺憾的是至今未見成功應用于生產的報道．日本已經通過基因組比較及轉錄分析發現了米曲霉對原料的有效降解機制［29］．我國科研人員仍需努力，進一步探討米曲霉菌株的基因與產品質量的關系．

［1］黃持都，魯緋，袁圓，等．季節性制曲效果比較研究［J］．中國釀造，2010(2):107-110．

［2］袁圓．低鹽固態醬油制取過程動態變化研究［D］．北京:中國農業大學，2010．

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［5］黃偉，麻成金，黃群，等．保靖醬油高產蛋白酶米曲霉菌種選育及產酶條件研究［J］．食品與發酵科技，2009，45(4):32-35．

［6］周其洋，陶文沂．米曲霉多酶系優良菌株的誘變選育［J］．中國調味品，2009，34(9):57-60．

［7］周傳云，聶明，萬佳蓉．醬油生產用菌誘變優化的研究［J］．食品研究與開發，2004，25(1):55-57．

［8］林祖申．UE336-2米曲霉菌株的誘變選育［J］．中國釀造，2004(11):24-26．

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［21］傅力，章運，艾乃吐拉，等．醬油生產中高產蛋白酶菌株米曲霉UF366［J］．食品科學，2008(9):427-430．

［22］黨敏娜，傅亮，歐仕益．鹽濃度對不同米曲霉所產中性蛋白酶活力的影響［J］．中國調味品，2005(7):18-19．

［23］湯鳴強，鄭挺，曾小芳，等．釀造醬油米曲霉產中性蛋白酶提取與酶學性質研究［J］．中國調味品，2008(2):38-40，50．

［24］張淑娟，田利強，王輅，等．米曲霉菌今野菌株所產蛋白酶性質的研究［J］．中國調味品，2001(11):15-17．

［25］李艷麗，許少春，許堯興，等．米曲霉ZW-06中性蛋白酶的粗分離及酶學性質研究［J］．中國飼料，2007(7):17-20．

［26］曾小波，伍麗瑜，宋小焱，等．醬油曲蛋白酶的分離及催化性質研究［J］．中國調味品，2010(1):50-52．

［27］張賀迎，武金霞，閆博．活性電泳分析米曲霉滬釀3.042蛋白酶組分［J］．中國釀造，2010(12):162-164．

［28］武金霞，閆博，張賀迎．醬油成曲淀粉酶組分的鑒定及單組分的分離純化［J］．中國調味品，2010(8):48-50．

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(責任編輯:王 寬)

Study on Aspergillus Oryzae Breeding in Production of Chinese Traditional Soy Sauce

JI Feng-di1， LU Fei1， CHENG Yong-qiang2
(1．Department of Food and Industrial Technology，Beijing Industrial Technology Research Institute，Beijing 101111，China;2．College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Aspergillus oryzae is the key organism in production of traditional soy sauce．The research of Aspergillus oryzae breeding included the strain breeding of high productivity of protease，enzyme characteristic，and conditions of enzymes producing，focusing on the strains of high productivity of protease．Though these studies have shown that the strain performance was improved comparing the original strain，the research was still limited to laboratory theoretical analysis．The application of Aspergillus oryzae in industrial production of soy sauce need further exploration．

soy sauce;Aspergillus oryzae;breeding;enzyme characteristic;gene

TS201.2

A

1671-1513(2012)04-0041-03

2012-04-16

國家自然科學基金資助項目(31171738)．

紀鳳娣，女，副研究員，博士，主要從事食品發酵技術方面的研究．