基于psbA－trnH分析的何首烏野生居群遺傳多樣性

白明明，孫小芹，郭建林，李密密，杭悅宇

〔江蘇省·中國科學院植物研究所(南京中山植物園)江蘇省植物遷地保護重點實驗室，江蘇 南京 210014〕

基于psbA－trnH分析的何首烏野生居群遺傳多樣性

白明明，孫小芹，郭建林，李密密，杭悅宇①

〔江蘇省·中國科學院植物研究所(南京中山植物園)江蘇省植物遷地保護重點實驗室，江蘇 南京 210014〕

對產自不同省區的何首烏〔Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.〕17個野生居群85個單株的psbA－trnH序列進行了擴增和分析，在此基礎上分析了居群間的遺傳多樣性，并采用NJ法對85個單株進行了聚類分析。結果表明:供試85個單株的psbA－trnH序列長度為384 bp;其中，變異位點為167 bp，簡約信息位點為53 bp，分別占序列總長度的43.5%和13.8%。變異類型主要為堿基缺失和替換;變異位點主要集中在235～281 bp區域，根據位點變異情況可將17個居群大體分為3類。各居群間的遺傳距離為0.000～0.172，其中，貴州居群與其他16個居群間的遺傳距離為0.167～0.172，而其他16個居群間的遺傳距離為0.000～0.017。17個居群間的核苷酸多樣性指數(Pi)、遺傳分化系數(Nst)和基因流(Nm)分別為0.028 56、0.918 68和0.04;除貴州居群外其他16個居群的Pi、Nst和Nm分別為0.015 68、0.837 19和0.10;貴州居群與其周邊省區(四川、云南、廣西、湖南和湖北)居群的Pi、Nst和Nm分別為0.047 99、0.937 62和0.03。在NJ系統樹上，17個居群可聚為4支，且大部分居群的供試單株聚在同一分支中;僅貴州居群單獨聚為一支，與序列分析的劃分結果基本一致。由研究結果可見:野生何首烏居群總遺傳變異的91.868%來自居群間，8.132%來自居群內，居群間的基因交流較少;除貴州居群外其余16個居群的整體遺傳多樣性水平偏低，說明何首烏居群整體多樣性水平在很大程度上受貴州居群的影響。

何首烏;居群;psbA－trnH序列;遺傳多樣性;NJ系統樹

何首烏〔Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.〕為蓼科(Polygonaceae)何首烏屬(FallopiaAdans.)多年生草本植物［1］，其塊根和藤莖均為傳統中藥材，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便的功效［2］。何首烏野生資源豐富，主要分布在安徽、福建、廣東、甘肅、廣西、貴州、湖北、河南、湖南、江蘇、江西、四川、山東、上海、陜西、云南和浙江。

目前，有關何首烏遺傳多樣性的研究非常少。王凌暉等［3］采用RAPD技術對廣西產10個野生何首烏居群進行了遺傳多樣性分析，用40對隨機引物共擴增出175個多態性片段，多態性百分率達59.3%;嚴寒靜等［4］采用PCR直接測序法測定何首烏10個種源核糖體DNA的ITS序列，共找到22個變異位點，其中ITS1區域有4個、ITS2區域有16個、5.8S區域有2個，序列間遺傳分化距離0.001 75～0.049 45。對于野生何首烏來說，上述研究涉及的樣品分布范圍并不廣、居群數也偏少，且所用片段的變異位點不能充分反映何首烏野生種質資源的遺傳結構。

psbA－trnH基因間隔區位于編碼光合系統Ⅱ反應中心DⅠ蛋白的psbA基因和編碼tRNA組氨酸的trnH基因之間，被認為是葉綠體基因組中進化速率最快的基因間隔區之一。目前，已將psbA－trnH序列分析用于薯蕷屬(DioscoreaL.)3個種［5］、石斛屬(DendrobiumSw.)15個種［6］和連翹〔Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl〕3個居群［7］的遺傳多樣性研究。

作者對采自17個省區的野生何首烏85個單株的psbA－trnH序列進行了分析，比較分析野生何首烏的遺傳多樣性，探討不同居群的遺傳變異程度，以期為其優良品種的選育和種質資源的研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的17個野生何首烏居群的分布地及基本地理信息見表1。憑證標本存放于江蘇省·中國科學院植物研究所標本館(NAS)，經江蘇省·中國科學院植物研究所杭悅宇研究員鑒定。于2010年在每個居群選取5株樣株，采集幼嫩且無病蟲害的干凈葉片，用變色硅膠干燥后保存、待用。

實驗用10×PCR buffer(含Mg2+)、TaqDNA聚合酶和dNTPs均購自上海博彩生物科技有限公司，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取參照文獻［8］采用改良CTAB法提取基因組總DNA。取10 mg葉片，在液氮中研磨后加入500 μL提取液于65℃水浴中保溫45 min，期間搖動30次;加入500 μL體積比24∶1的氯仿－異戊醇混合液，混合均勻，12 000 r·min－1離心10 min;取上清液，加入2倍體積無水乙醇，－20℃放置1 h以上;4 000 r·min－1離心10～20 min使DNA沉淀;用700 μL體積分數70%乙醇清洗1次，4 000 r ·min－1離心5～10 min;再用700 μL無水乙醇清洗1次，4 000 r·min－1離心5～10 min;得到DNA沉淀，晾干，最后加入100 μL水或TE溶解DNA。

1.2.2psbA－trnH序列的擴增及產物檢測根據GenBank中發布的何首烏psbA－trnH序列(GenBank登錄號為EU554047.1)，采用Primer Premier 5.0軟件自行設計psbA－trnH序列引物，FHS和FHA引物序列分別為5'－TTCCCGCTAGACCTAGCTGC－3'和5'－ACTGCCTTGATCCACTTGGC－3'。

擴增反應在PE－9600型PCR儀(Perkin Elmer公司生產)上進行。擴增反應體系總體積20 μL，含30 ng模板DNA、10×PCR buffer(含Mg2+)2 μL、10 mmol·L－1dNTPs 0.3 μL、5 μmol·L－1引物2 μL和5 U·μL－1TaqDNA聚合酶0.2 μL，用滅菌雙蒸水補足至20 μL。擴增程序為:94℃預變性5 min; 94℃變性40 s，58℃退火40 s，70℃延伸45 s，共30個循環;最后于72℃延伸5 min。

表1 供試何首烏野生居群的基本概況1)Table 1 Basic status of wild populations of Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.tested1)

擴增產物與6×甘油凝膠上樣液混合后，用質量體積分數0.8%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg·mL－11×EB)進行電泳檢測，電泳時間約40 min。電泳結束后用WV－BP330型凝膠掃描分析系統(江蘇捷達科技發展有限公司生產)觀察擴增結果并拍照。

1.2.3 擴增片段的純化和序列測定PCR擴增產物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行純化，純化后使用引物FHS和FHA直接進行雙向測序，測序由上海華大基因有限公司完成。

1.3 序列分析

采用Sequencher軟件進行峰圖文件的編輯和拼接，拼接好的序列用MEGA 4.1軟件進行多重序列比對(multiple sequence alignment，MSA)，對序列長度、保守位點、變異位點和簡約信息位點等序列特征進行分析［9］;通過Kimura 2－parameter(K2P)模型計算遺傳距離，構建距離矩陣［10］;應用DnaSP 5.10［11］軟件計算核苷酸多樣性指數［12］、基因流［13］和居群間遺傳分化系數［13］;以萹蓄(PolygonumaviculareL.) (GenBank登錄號為FJ395458.1)為外類群，通過鄰接法(neighbor-joining method，NJ)構建基于遺傳距離的聚類圖，構建的系統發育樹采用1 000次循環的自舉檢驗法(bootstrap test)檢驗各分支的置信度，空缺(gap)始終作為缺失(missing)處理［14］。

2 結果和分析

2.1 何首烏居群psbA－trnH序列擴增結果分析

供試的85個野生何首烏單株psbA－trnH序列的長度為243～434 bp，排序后兩端切平獲得的序列長度為384 bp，當空缺(gap)始終作缺失(missing)處理時，保守位點有217 bp，占序列總長度的56.5%;變異位點有167 bp，占序列總長度的43.5%，變異類型主要為堿基缺失和替換。其中，簡約信息位點有53 bp，占序列總長度的13.8%。

2.2 何首烏居群psbA－trnH序列的差異分析

何首烏不同居群psbA－trnH序列變異位點的比較結果見表2。由表2可見:何首烏不同居群間和單株間psbA－trnH序列均存在堿基變異位點，主要集中在235～281 bp區域。福建、廣東、湖北、湖南、江西、四川和浙江居群的所有單株，山東居群的4號單株，上海居群的2號和4號單株，廣西居群的1～4號單株以及云南居群的2～5號單株的psbA－trnH序列在235～281 bp位點的堿基序列依次為TATGGCCTCT TTGGTGT(或G)TTTG(或T或A)GTTGGGTGGACT TTTTTTTGATTCAT;貴州居群5個單株的psbA－trnH序列在235～281 bp位點的堿基序列依次為TCTCCCTCTTT－－TGTTTT－－－－GGG－GGAAATTTCTTT－－TTCTT(“－”表示堿基缺失)。比較而言，貴州居群psbA－trnH序列235～281 bp區域間有16個變異位點，與其他11個居群的差異較大。在251 bp位置，其他11個居群的堿基分別為T和G，其中，福建、湖北、江西、四川和浙江居群的所有單株，山東居群的4號單株，上海居群的2號和4號單株及云南居群的2～5號單株的堿基為T;廣東和湖南居群的所有單株以及廣西居群的1～4號單株的堿基為G。在255 bp位置，福建、湖北、江西和浙江居群的所有單株，山東居群的4號單株以及上海居群的2號和4號單株的堿基為G;廣東和湖南居群的所有單株以及廣西居群的1～4號單株的堿基為T;四川居群的5個單株和云南居群的2～5號單株的堿基為A。

安徽、甘肅、河南、江蘇和陜西居群所有單株的psbA－trnH序列在235～281 bp位點的堿基均缺失;山東居群的1～3號和5號單株，上海居群的1號、3號和5號單株，廣西居群的5號單株及云南居群的1號單株在這段序列位點也存在堿基缺失。

根據psbA－trnH序列235～281 bp區域的堿基差異，17個野生何首烏居群可被劃分為3大組:第1組包括福建、廣東、湖北、湖南、江西、四川、浙江、廣西和云南居群;第2組僅貴州居群，其特征為235～281 bp序列與第1組相比有16個變異位點;第3組包括安徽、甘肅、河南、江蘇、陜西、山東和上海居群，其特征為235～281 bp區域堿基缺失。另外，第1組又可分為3小組:第1小組包括廣東、湖南和廣西居群，其251 bp位點的堿基為G、255 bp位點的堿基為T;第2小組包括福建、湖北、江西和浙江居群，其251和255 bp 2個位點的堿基恰好與第1小組完全相反;第3小組包括四川和云南居群，其251和255 bp的堿基分別為T和A。

表2 何首烏17個野生居群psbA－trnH序列變異位點的比較Table 2 Comparison of variable sites in psbA-trnH sequence of seventeen wild populations of Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.

續表2Table 2 (Continued)

續表2>Table 2 (Continued)

2.3 何首烏居群的遺傳多樣性分析

采用MEGA 4.1軟件中的Kimura 2－parameter模型計算何首烏不同居群間psbA－trnH序列的遺傳距離并構建序列距離矩陣，結果見表3。何首烏各居群間的遺傳距離為0.000～0.172;其中，貴州居群與其他居群間的遺傳距離均較大，為0.167～0.172;其他居群間的遺傳距離均較小，為0.000～0.017。

何首烏17個野生居群的核苷酸多樣性指數為0.028 56±0.005 43，居群間的遺傳分化系數達到0.918 68，基因流為0.04。說明17個何首烏野生居群總遺傳變異的91.868%來自居群間，8.132%來自居群內，居群間的基因交流較少。

由于貴州居群的psbA－trnH序列與其他居群有較大差異，因此，對其他16個居群以及貴州居群與其周邊省區居群的遺傳多樣性進行了分析，結果顯示:其他16個居群的核苷酸多樣性指數為0.015 68± 0.000 77，居群間遺傳分化系數為0.837 19，基因流為0.10;貴州居群與其周邊省區(四川、云南、廣西、湖南和湖北)居群的核苷酸多樣性指數為0.047 99± 0.010 88，居群間遺傳分化系數為0.937 62，基因流為0.03。說明其他16個何首烏野生居群的整體遺傳多樣性水平偏低;貴州居群與其周邊省區居群的遺傳分化系數大于其他16個居群，基因交流則小于其他16個居群，說明何首烏野生居群的遺傳多樣性整體水平在很大程度上受貴州居群的影響。

表3 何首烏17個野生居群間的遺傳距離1)Table 3 Genetic distance among seventeen wild populations of Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.1)

2.4 何首烏居群的聚類分析

以萹蓄為外類群，依據遺傳距離、采用鄰接法(NJ)對何首烏17個野生居群進行聚類分析并構建遺傳關系樹，結果見圖1。由圖1可看出:17個何首烏野生居群的85個單株可聚成4支。浙江、江西、湖北、福建和四川居群的所有單株，山東居群的4號單株，上海居群的2號和4號單株及云南居群的2～5號單株聚在一起成為第1支，自展支持率達57%，其中，四川居群的5個單株和云南居群的2～5號單株又獨立成支，與其他居群分離，但自展支持率僅為54%。廣東和湖南居群的所有單株及廣西居群的1～4號單株聚在一起成為第2支，自展支持率達86%。第3支包括安徽、甘肅、河南、江蘇和陜西居群的所有單株，云南居群的1號單株，廣西居群的5號單株，上海居群的1號、3號和5號單株及山東居群的1～3號和5號單株，自展支持率達99%，其中安徽居群相對獨立。第4支是與其他居群遺傳關系較遠的貴州居群的5個單株，自展支持率為99%，與其他居群明顯分離，但與外類群關系相對較近。

通過比較可見:何首烏野生居群的聚類結果與psbA－trnH序列分析的劃分結果基本一致。

3 討論和結論

遺傳多樣性是生物在長期進化和發展過程中形成的自然屬性，其不僅體現在種群間和種群內，也體現在不同個體間，是種群和個體遺傳變異的總和［15］。特定物種的遺傳多樣性是該物種長期生存、進化和適應的結果［16］。一般來說，自交物種的核苷酸多樣性指數平均值為0.51，異交物種則小于0.1［17］，而何首烏野生居群的核苷酸多樣性指數僅0.028 56。Buso等［18］認為遺傳分化系數大于0.25則表示居群間的分化程度很大，而本研究中何首烏居群間的遺傳分化系數達到0.918 68。Slatkin［19－20］將基因流分為高(大于或等于1.000)、中(0.250～0.990)、低(0.000～0.249)3個等級，本研究中何首烏居群間的基因流為0.04，屬于低等級。因而，總體上看何首烏野生居群整體遺傳多樣性水平偏低，居群間遺傳分化很大，但居群間的基因流遠小于標準，說明遺傳漂變是影響何首烏居群遺傳結構的主導因素［21］。而何首烏居群間的基因流不足以完全抵制由遺傳漂變而引起的居群分化，這也是何首烏居群遺傳多樣性水平偏低和居群間遺傳分化系數較大的原因。

圖1 基于psbA－trnH序列分析的何首烏17個野生居群的NJ系統樹Fig.1 NJ phylogenetic tree of seventeen wild populations of Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.based on psbA-trnH sequence analysis

研究結果表明:除貴州居群外，供試的其他16個居群間的基因流為0.10，遺傳分化系數為0.837 19;而貴州居群與其周邊省區(四川、云南、廣西、湖南和湖北)居群間的基因流僅為0.03，遺傳分化系數卻達到0.937 62，明顯大于其他16個居群間。推測造成這一現象的原因可能是由于云貴高原具有較特殊的喀斯特地貌，由此形成的地理隔離阻礙了基因交流，導致分化較大。因此，何首烏居群的整體多樣性水平在很大程度上受貴州居群的影響。從形態上看，17個居群的何首烏外部形態特征基本一致，但貴州居群植株主、側葉脈的白斑程度最大，葉竇凹陷程度最小，花序長度最短，葉長寬比和宿存花被長度相對較小，開花期相對較晚(另文發表)。貴州居群在形態上的差異得到了psbA－trnH序列分析及聚類分析(自展支持率99%，與供試的其他16個居群明顯分離)結果的支持，證明貴州居群確實與其他居群存在較大差異，表現出特殊的形態和遺傳特性。推測貴州居群可能是何首烏的1個新變種，但還需多學科研究驗證。

聚類分析結果表明:17個何首烏野生居群中有13個居群各自的5個單株聚在一起，僅山東、云南和廣西居群各有1個單株與同居群大部分單株較遠而被聚到其他分支中，而上海居群的2號和4號單株聚在第1支中，1號、3號和5號單株則聚在第3支中。說明各居群不同單株基于psbA－trnH序列的遺傳背景基本一致，僅有少量變異，這一現象可能與這些居群單株間分布的地理環境生態因子不同有關。在進化發展過程中同種不同個體所承受的生境選擇存在一定差異，使個體在各自的自然環境下發生了變異。有研究者在黃獨(Dioscorea bulbiferaL.)遺傳多樣性研究中也觀察到這一現象［22］，因而，同一居群不同個體間存在變異的情況并不少見。

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(責任編輯:佟金鳳)

Genetic diversity of wild populations of Fallopia multiflora based on psbA-trnH analysis

BAI Ming-ming，SUN Xiao-qin，GUO Jian-lin，LI Mi-mi，HANG Yue-yu①(Jiangsu Province Key Laboratory for PlantEx-situConservation，Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China)，J.Plant Resour.＆Environ.2012，21(2):36－44

Sequence ofpsbA-trnH of 85 individuals in 17 wild populations ofFallopia multiflora(Thunb.) Harald.from different provinces and regions in China was amplified and analyzed，and on the basis，genetic diversity among populations was analyzed and cluster analysis of 85 individuals was also carried out by NJ method.The results show that the length ofpsbA-trnH sequence of 85 individuals is 384 bp，in which，there are 167 bp variable sites and 53 bp parsimony informative sites，accounting for 43.5%and 13.8%of the total length of sequence，respectively.Variable types are mainly base deletion and substitution.Variable sites mainly concentrate in the region of 235－281 bp.17 populations are almostly divided into three types according to site variation status.The genetic distances among 17 populations are 0.000－0.172，in which，genetic distances between Guizhou population and other 16 populations are 0.167－0.172，and those among other 16 populations are 0.000－0.017.Nucleotide diversity index (Pi)，coefficient of gene differentiation(Nst)and gene flow(Nm)among 17 populations are 0.028 56，0.918 68 and 0.04，respectively.Pi，Nst andNm among other 16 populations except Guizhou population are 0.015 68，0.837 19 and 0.10，respectively.AndPi，Nst andNm between Guizhou population and its neighboring populations(Sichuan，Yunnan，Guangxi，Hu’nan and Hubei)are 0.047 99，0.937 62 and 0.03，respectively.On NJ phylogenetic tree，17 populations are clustered into four branches and individuals tested in most populations are clustered in a same branch and only Guizhoupopulation is clustered alone in a branch，which is basically same with the deviation result by sequence analysis.It is suggested that 91.868%of overall genetic variation of 17 wild populations exists among populations and 8.132%within populations，and gene exchange among populations is less.Except Guizhou population，overall genetic diversity level among other 16 populations is low，indicating that the overall diversity level ofF.multiflorapopulations is affected by Guizhou population at a large extent.

Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.;population;psbA-trnH sequence;genetic diversity; NJ phylogenetic tree

book=2012,ebook=77

Q946－33;S567.23+9

A

1674－7895(2012)02－0036－09

2011－12－27

國家農業部DUS測試品種信息DNA測試技術研究項目(200903008－02－05)

白明明(1987—)，女，山東郯城人，碩士研究生，主要從事藥用植物資源的研究。

①通信作者E-mail:hangyueyu@21cn.com