TIMP-3和mtp53在非小細胞肺癌中的表達及意義

楊紅 李婕 郭嘉 張尚福

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，患者的5年和10年生存率分別為14%和8%[1]。近年來肺癌的診斷和治療技術取得了一定進步，但肺癌患者的生存率并未明顯提高。肺癌常在早中期發生鄰近組織、器官的浸潤及淋巴結轉移，是其治療失敗的主要原因?；|金屬蛋白酶組織抑制劑-3（tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP-3）在抑制腫瘤的浸潤和轉移方面發揮作用，且與突變型p53（mutant-type p53, mtp53）存在一定的相關性。本研究利用組織芯片技術和免疫組織化學染色方法檢測TIMP-3和mtp53在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）組織及其淋巴結轉移灶中的表達情況，探討它們與NSCLC的轉移、組織學類型、病理分級、TNM分期和預后等方面的關系以及二者之間的相關性，為臨床預防腫瘤轉移的治療措施提供可能的依據。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四川大學華西醫院1998年1月-2001年12月接受根治性手術治療且保存有完整臨床資料和石蠟組織塊的NSCLC病例，按照2003年WHO肺腫瘤組織學分類的標準，對其組織學類型、病理分級、有/無轉移進行評判。共篩選出原發性NSCLC 288例，男性223例，女性65例，平均年齡59.5歲（29歲-82歲）；鱗狀細胞癌（以下簡稱為鱗癌）125例，腺癌129例，腺鱗癌34例；高分化癌27例，中分化癌112例，低分化癌115例（34例腺鱗癌無法進行分級）；伴有轉移的原發灶肺癌組織150例，實際收集其淋巴結轉移灶癌組織106例。根據2007年肺癌國際TNM分期修訂版標準：I期98例，II期53例，III期102例，IV期35例。選取同期手術的24例良性病變（包括肺結核、囊腫、炎性假瘤及錯構瘤）肺支氣管粘膜上皮組織作為對照?；颊咝g前均未行放療或化療，并行術后隨訪，截止日期為2006年8月31日，中位生存時間29個月。生存期的計算從診斷日期起至隨訪日期或由于復發、轉移而死亡的日期為止。

1.2 組織芯片的制作 本實驗采用手工制作組織芯片。首先選擇所需病例的存檔蠟塊，根據HE染色切片進行形態學觀察，確定具有代表性的病變部位（避開出血、壞死、明顯炎細胞浸潤及纖維化區域）后在HE切片和相應石蠟組織塊上標記。根據樣本的數量及所要求組織片的大小在空白石蠟塊（組織芯片專用）上鉆孔，此實驗選用鉆頭的直徑為1.5 mm，再用金屬空心管（內徑仍為1.5 mm）從經定位的目標石蠟塊上鉆取組織并轉移至已鉆孔的空白石蠟塊的相應位置。每一個選中蠟塊（包括原發灶癌組織、轉移灶癌組織和對照組織）選3個組織芯放入芯片中（對有可能掉片的病例選4個組織芯放入芯片中）。使用病理切片機制備4 μm組織切片，置于經防脫片處理的載玻片上，放入56oC烤箱中烘烤48 h。常溫保存備用。

1.3 免疫組織化學染色 TIMP-3為兔抗人多克隆抗體（購自博士德生物技術開發有限公司），工作稀釋度為1:100，用微波枸櫞酸進行抗原修復，以胎盤絨毛作為陽性對照，采用LSAB法染色（SP法，試劑盒購自北京中山金橋生物技術開發有限公司）。mtp53抗體為鼠抗人單克隆抗體（購自福州邁新生物技術開發有限公司），工作稀釋度為1:50，用水浴EDTA進行抗原修復，以乳腺癌作為陽性對照，采用Elivision法染色（試劑盒購自Dako生物技術開發公司）。

1.4 免疫組織化學結果評定 TIMP-3以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性，mtp53以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性。將芯片內所有癌細胞都納入計數范圍內，將著色強度高于背景的細胞定為陽性細胞。細胞質和細胞核內的棕黃色顆粒都分別根據陽性細胞的染色強度（未著色：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分）和陽性細胞所占的構成比評分（全陰：0分；≤10%：1分；11%-50%：2分；51%-75%：3分；＞75%：4分）；將每例獲得的兩組分數相乘：0-3分為（-）；4分-7分為（+）；8分-12分為（++）[2]。

1.5 統計學處理 使用SPSS 13.00 統計軟件進行數據處理，采用卡方檢驗、Spearman等級相關分析、Log-rank檢驗等統計分析方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TIMP-3和mtp53在良性病變、NSCLC原發灶癌和淋巴結轉移灶癌中的表達情況 TIMP-3在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細胞中均呈陽性表達（100%）；288例NSCLC原發灶肺癌組織中呈（-）表達42例（14.6%）、（+）表達101例（35.1%）、（++）表達145例（50.3%），其陽性表達率為85.4%；106例淋巴結轉移灶癌組織中呈（-）表達25例（23.6%）、（+）表達38例（35.8%）、（++）表達43例（40.6%），其陽性表達率為76.4%。原發灶與淋巴結轉移灶癌組織TIMP-3的表達明顯低于正常支氣管黏膜上皮組織（P＜0.01）。見圖1。

mtp53在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細胞中均呈陰性表達；288例NSCLC原發灶癌組織中呈（-）表達161例（55.9%）、（+）表達54例（18.8%）、（++）表達73例（25.3%），其陽性表達率為44.1%；在106例淋巴結轉移灶癌組織中呈（-）表達53例（50.0%）、（+）表達27例（25.5%）、（++）表達26例（24.5%），其陽性表達率為50.0%。原發灶與淋巴結轉移灶癌組織mtp53的表達明顯高于正常支氣管粘膜上皮組織（P＜0.01）。見圖2。

2.2 TIMP-3和mtp53的表達與轉移的關系 不伴有淋巴結轉移的138例原發灶癌組織中TIMP-3呈（-）表達14例（10.1%）、（+）表達43例（31.2%）、（++）表達81例（58.7%），而伴有淋巴結轉移的150例原發灶癌組織中TIMP-3呈（-）表達28例（18.6%）、（+）表達58例（38.7%）、（++）表達64例（42.7%），兩組表達差異有統計學意義（P=0.015）。不伴有淋巴結轉移的138例原發灶癌組織中mtp53呈（-）表達88例（63.8.1%）、（+）表達23例（16.7%）、（++）表達27例（19.5%），而伴有淋巴結轉移的150例原發灶癌組織中mtp53呈（-）表達73例（48.6%）、（+）表達31例（20.7%）、（++）表達46例（30.7%），兩組表達差異有統計學意義（P=0.030）。

2.3 TIMP-3和mtp53的表達與病理學分級、組織學類型及TNM分期之間的關系 見表1。TIMP-3的表達與NSCLC的病理學分級有關，在高分化癌細胞中的表達高于中分化和低分化癌細胞，差異有統計學意義（P=0.030）；TIMP-3的表達與NSCLC的組織學類型和TNM分期無關（P＞0.05）。mtp53的表達與NSCLC的組織學類型和TNM分期有關（P=0.004, P=0.016），其在腺癌中的表達最低，在腺鱗癌中的表達最高，隨TNM分期的增加而增加，與NSCLC的病理學分級無關（P=0.347）。

2.4 TIMP-3和mtp53表達的相關分析 Spearman等級相關分析顯示TIMP-3與mtp53在NSCLC癌組織中的表達呈負相關（r=-0.156, P=0.008）。

2.5 TIMP-3和mtp53的表達與患者生存的關系 分析TIMP-3和mtp53在NSCLC病灶中的表達與患者的術后生存率有關：TIMP-3在病灶中呈（++）表達的NSCLC患者生存率最高，呈（-）表達者生存率最低，差異有統計學意義（χ2=9.055, P=0.011）；mtp53呈（-）表達的NSCLC患者生存率最高，呈（++）表達者生存率最低，差異有統計學意義（χ2=11.829, P=0.003）（圖3）。

3 討論

TIMPs能特異性的抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）的活性，阻止細胞外基質的降解，從而抑制腫瘤的轉移。大量研究顯示TIMP-3的表達與腫瘤的預后有很大的相關性，Powe等[3]研究發現在結腸低分化腺癌的浸潤邊緣TIMP-3的表達明顯降低，提示邊緣TIMP-3表達的降低與腫瘤浸潤有很大的關系；TIMP-3的表達降低是食管癌的浸潤增強、分期增加和預后較差的主要原因[4,5]；Span等[6]發現在乳腺癌中，TIMP-3高表達的患者比低表達者預后好，Celebiler等[7]的研究結果也顯示TIMP-3的低表達促進了乳腺癌轉移；Mino等[8]研究TIMP-3在肺癌中的表達發現，TIMP-3的弱、中、強表達率差異在鱗癌中表現更為明顯，TIMP-3的低表達與淋巴結的轉移相關，TIMP-3與患者的生存預后相關。這些研究結果都表明TIMP-3表達的降低會導致腫瘤更具有浸潤和轉移的能力，而Riddick等[9]在前列腺癌中發現TIMP-3的表達與預后沒有明顯的相關性，而高表達與淋巴結的轉移相關，但是在局部還是有抑制腫瘤生長的作用；Kornfeld等[10]的研究結果顯示在頭頸部的鱗狀細胞癌中TIMP-3 mRNA高表達者預后較低表達者更差?？傊?，TIMP-3在不同腫瘤中的作用機制還不是很一致，還需要大量的研究證明。本實驗發現TIMP-3在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細胞中均呈100%表達，而在288例NSCLC原發灶癌組織中陽性表達已降為85.4%；且在伴有淋巴結轉移的原發灶癌組織中TIMP-3表達明顯低于不伴有淋巴結轉移的原發灶。因此我們推測TIMP-3的低表達與NSCLC的淋巴結轉移有關，這與Mino等[8]的研究結果一致。本研究結果中TIMP-3的表達與NSCLC的TNM分期無關，推測主要受腫瘤大小影響。本實驗還發現TIMP-3的表達與NSCLC的分化程度有關，NSCLC分化越好，TIMP-3的表達率越高；但TIMP-3的表達與NSCLC的組織學類型無關，這與Mino等[8]研究結果不一致，可能由于人種和地域的差異，這方面需要更進一步的研究和分析。

表1 TIMP-3和mtp53在不同非小細胞肺癌病變組織中表達差異的分析Tab 1 Analysis of expression difference of TIMP-3 and mtp53 in distinct non-small cell lung cancer (NSCLC) pathological tissues

圖1 TIMP-3在肺良性病變支氣管粘膜上皮組織（A）、鱗狀細胞癌（B）、腺癌（C）與腺鱗癌（D）中的表達（LSAB，×400 ）Fig 1 The expression of TIMP-3 in benign lesion's bronchus mucosa epithelium (A), squamous cell carcinoma (B), adenocarcinoma (C) and adenosquamous carcinoma (D) (LSAB, ×400)

圖2 mtp53在肺良性病變支氣管黏膜上皮組織（A）、鱗狀細胞癌（B）、腺癌（C）與腺鱗癌（D）中的表達（Elivision，×400）Fig 2 The expression of mtp53 in benign lesion's bronchus mucosa epithelium (A), squamous cell carcinoma (B), adenocarcinoma (C) and adenosquamous carcinoma (D) (Elivision, ×400)

圖3 TIMP-3（A）與mtp53（B）在NSCLC患者中不同表達情況的Kaplan-Meier生存曲線Fig 3 Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with expression of TIMP-3 (A) and mtp53 (B)

肺癌患者p53基因突變率居人類腫瘤的首位，其基因功能的失活在肺癌的發生發展中起著重要作用，60%的NSCLC和80%的小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）可檢測到p53基因的突變[11]。張霞等[12]研究表明mtp53蛋白在肺癌中表達率為51.8%，其表達率與腫瘤的分化程度有關，分化越差，表達率越高。李愛武等[13]研究發現，NSCLC癌組織的mtp53蛋白表達（60%）較正常肺組織（5%）明顯增高，提示p53突變可能參與了肺癌的發生發展過程，其中mtp53蛋白在肺腺癌組織中的表達分別高于腺鱗癌及鱗癌，原發腫瘤T3-T4組織中的mtp53蛋白表達較原發腫瘤T1-T2高，mtp53蛋白在低分化癌組織中的表達較中、高分化癌組織高，說明mtp53蛋白的表達與腫瘤的病理學類型、原發腫瘤范圍及分化程度有關。本實驗結果中mtp53在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細胞中均不表達，而在288例NSCLC原發灶癌組織中陽性表達為44.1%；且在伴有淋巴結轉移的原發灶癌組織中mtp53表達明顯高于不伴有淋巴結轉移的原發灶；同時mtp53的表達隨NSCLC的TNM分期增加而升高。本研究中mtp53的表達在腺癌中最低，其次為鱗癌，在腺鱗癌中表達最高，因此mtp53的表達與NSCLC組織學類型的關系還有待于進一步研究。

關于TIMP-3和mtp53的相關性在肺癌的發生、轉移和預后中的研究甚少。Thomas[14]和Loging等[15]發現mtp53具有抑制TIMP-3表達的作用，從而使受TIMP-3抑制的MMPs表達增加，達到抑制腫瘤細胞凋亡和促進腫瘤組織內血管形成的作用，促進腫瘤的生長、浸潤與轉移。Zalcenstein等[16]通過體外實驗發現mtp53可以通過抑制Fas啟動子的活性，下調Fas mRNA的轉錄來抑制Fas的表達，從而進一步抑制了TIMP-3通過Fas途徑誘導細胞的凋亡。本研究結果也顯示，TIMP-3與mtp53在NSCLC組織中的表達存在負相關，與文獻報道一致，但其分子機制需要進一步的研究。

綜上，TIMP-3的低表達與mtp53的高表達都可以促進NSCLC的轉移且二者之間存在抑制作用，可以考慮從增加TIMP-3的表達、降低mtp53的表達方面著手研究更好的腫瘤治療方法。臨床上也可將二者結合起來，有助于提高對NSCLC發生轉移可能性和預后等方面預測的準確性，或可能成為NSCLC患者預防腫瘤轉移的一種治療措施。