黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-1基因克隆和序列分析

付冠華，李 端，周晨妍

（新鄉醫學院生命科學技術系，河南省醫學遺傳學與分子靶向藥物高校重點實驗室培育基地，河南新鄉 453003）

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-1基因克隆和序列分析

付冠華，李 端，周晨妍*

（新鄉醫學院生命科學技術系，河南省醫學遺傳學與分子靶向藥物高校重點實驗室培育基地，河南新鄉 453003）

利用RT-PCR技術從黑曲霉XZ-3S中擴增并克隆了木聚糖酶（Xyn ZF-1）基因的cDNA片段，測序結果表明，Xyn ZF-1基因核苷酸序列閱讀框全長678bp，編碼225個氨基酸，推測分子量為24.06ku，等電點為5.20。以XZ-3S基因組DNA為模板擴增Xyn ZF-1的DNA序列，該序列僅存在一個內含子，長度為68bp。成熟肽基因推導的氨基酸序列與其他微生物來源的木聚糖酶一級結構進行比較，同源性最高達到了89.47%。系統進化樹分析該酶屬于G/11族糖基水解酶。又進一步對Xyn ZF-1二級結構進行了分析，并通過SWISS-MODEL預測了該酶的三維結構。

黑曲霉，木聚糖酶，基因克隆，序列分析

Abstract：The cDNA of xylanase（Xyn ZF-1） gene was amplified from the Aspergillus niger XZ-3S total RNA by RT-PCR.The result showed that Xyn ZF-1 was 678bp in size and encoded 225 amino acids.The molecular weight and theoretical isoelectric point was 24.06ku and 5.20，respectively.The DNA of Xyn ZF-1 gene was amplified from the Aspergillus niger XZ-3S genmic DNA by PCR.The result confirmed that there was only one intron with the 68bp in length.The homology analysis of amino acid sequence shared 89.47%in base sequence with other microbial xylanase primary structure.Phylogenetic analysis showed that the enzyme belongd to glycosyl hydrolase family G/11.Besides，the secondary structure of Xyn ZF-1 was analysed，and threedimensional structure of Xyn ZF-1 was predicted by SWISS-MODEL.

Key words：Aspergillus niger；Xylanase；gene cloning；sequence analysis

木聚糖（Xylan）是植物半纖維素的主要成分，是僅次于纖維素的第二豐富的可再生資源。木聚糖結構十分復雜，它的完全降解需要多種水解酶的參與而共同完成，其中β-1，4-內切木聚糖酶（EC 3.2.1.8）能夠以內切方式作用于木聚糖主鏈產生不同長度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶系中最關鍵的酶[1-2]。木聚糖酶被廣泛地應用于造紙、食品、飼料等行業中，尤其是當今世界能源日益緊缺，如何有效利用資源越來越受到人們的關注[1，3]。根據木聚糖酶催化區域的氨基酸序列組成和疏水簇分析，可將其歸為F/10和G/11兩大家族，同一家族中的木聚糖酶催化區域具有較高的同源性。G/11木聚糖酶多為單結構域，相對分子質量一般在19～25ku，酶最適溫度50～60℃，有一個β-膠狀卷曲結構；F/10木聚糖酶則含有較多結構域，不僅有催化結構域，還存在纖維素結合結構域（Cellulose Binding Domain：CBD），相對分子質量一般大于30ku，酶最適溫度60～80℃，有一個（αβ）8桶狀結構[4-6]。Bernier等首次從Bacillus subtillis PAP II 5中分離得到木聚糖酶基因（Xyn）以來，Maconukul等[7-9]先后克隆并分析了來自細菌、放線菌、霉菌、酵母菌和藻類等300多種不同生物來源的木聚糖酶基因，其中上百種基因在不同宿主中進行了表達。張茂等[10]從黑曲霉GIM3.452中克隆得到木聚糖酶XynA的成熟肽編碼序列，并將其片段插入真核表達載體，在脂質體介導下成功將重組表達載體轉入PK15細胞，最終實現了異源基因分泌表達。黑曲霉XZ-3S是本實驗室保藏的一株高產木聚糖酶菌株。本研究旨在克隆Xyn ZF-1基因，并對該基因序列及推導的氨基酸序列進行詳盡的分析，為進一步研究該基因的生物學功能和工程菌的構建奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S、質粒轉化受體菌大腸桿菌（Escherichia coli）JM109 新鄉醫學院生命科學技術系酶與發酵工程實驗室保存；TA克隆載體pUCm-T質粒、RNA分離TRIzol試劑、飽和酚、氨芐青霉素（Amp） Sangon公司；TaKaRa RNA PCR試劑盒（AMV）Ver.3.0、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、蛋白酶K、IPTG、X-galTaKaRa生物工程（大連）有限公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒 生工生物工程（上海）有限公司；DNA MarkerMBI公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖 BBI公司；溴化乙錠 Amresco公司；其他主要生化試劑 為進口產品或國產分析純；P1、P2、P3引物 由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成。

L-Broth（LB） 蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母粉5g/L，pH7.4；用于培養含Ampr質粒的E.coli時，添加Amp濃度為100μg/mL；LB固體培養基，添加20g/L的瓊脂粉；黑曲霉液體發酵培養基 蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖10g/L，200mL/L的玉米芯提取液[11]，自然pH。發酵條件：28℃，110r/min，培養36h，收集菌體用于XZ-3S總RNA，總基因組DNA提取。

梯度PCR擴增儀C1000 Bio-Rad Laboratory；穩壓穩流電泳儀（DYY-2） 北京市六一儀器廠；Touching 956數碼相機凝膠成像系統 上海天呈科技有限公司；恒溫振蕩器（HZQ-F160A） 上海一恒科學儀器有限公司；低溫恒溫槽（DC-0506） 上海比朗儀器有限公司；高速冷凍離心機（Neofuge 23R） 上海力申科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR引物設計、合成 通過對GenBank中真菌木聚糖酶相關基因的比較，以起始密碼子和終子密碼子附近相似度較高序列為參照，設計了以下引物：

上游引物

下游引物

1.2.2 黑曲霉總RNA和基因組DNA的提取 黑曲霉培養液經抽濾、無菌水洗滌菌體數次，采用TRIzol試劑一步法提取總RNA，具體操作參照TRIzol使用說明書。通過測定A260/A280，檢測RNA提取的純度。黑曲霉基因組DNA的提取參照文獻[12]。

1.2.3 目的基因的擴增

1.2.3.1 RT-PCR擴增cDNA片段 在反應體系中以總RNA為模板，具體反應體系為：MgCl22μL，10×RT Buffer 1μL，RNase Free dH2O 3.75μL，dNTP Mixture 1μL， RNase Inhibitor0.25μL， AMV Reverse Transcriptase 0.5μL，Oligo dT-Adaptor Primer 0.5μL，總RNA 1μL，共10μL；反應條件為：50℃ 30min，99℃5min，5℃ 5min。具體反應液配制及反應條件參見TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒說明書。

在PCR反應體系中，以cDNA第一條鏈為模板，具體反應體系為：5×PCR Buffer 10μL，滅菌蒸餾水28.75μL，TaKaRa Ex Taq? HS 0.25μL，5’端引物P1 0.5μL，3’端引物M13 0.5μL，逆轉錄產物 10μL，共50μL；反應條件為：94℃ 2min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，35個循環；72℃延伸10min。擴增產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3.2 PCR擴增基因組DNA片段 以基因組DNA為模板進行擴增，其反應體系組成為：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，無菌水19μL，Taq酶0.5μL，5’端引物P1 0.5μL，3’端引物P3 0.5μL，DNA 1μL，共25μL；反應條件為：95℃ 10min；94℃ 30s，52℃ 45s，72℃1min，35個循環；72℃延伸10min。擴增完畢，取樣用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 回收產物驗證

1.2.4.1 總RNA擴增產物驗證 以總RNA膠回收產物為模板，分別以P1/M13、P1/P3、P2/P3為引物，PCR擴增相應DNA片段。反應體系：DNA 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Taq酶0.5μL，無菌水19μL，共25μL；反應條件為：94℃ 2min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，35個循環；72℃延伸10min。擴增完畢，分別取樣用1.0%的瓊脂糖凝膠驗證擴增結果。

1.2.4.2 基因組DNA擴增產物驗證 以基因組DNA膠回收產物為模板，分別以P1/P3、P2/P3為引物，PCR擴增相應DNA片段。PCR反應體系：DNA 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Taq酶0.5μL，無菌水19μL，共25μL；反應條件為：95℃ 8min；94℃ 30s，52℃ 45s，72℃ 1min，35個循環；72℃延伸10min。擴增完畢，分別取樣用1.0%的瓊脂糖凝膠驗證擴增結果。

1.2.5 連接反應 連接體系：膠回收產物7μL，pUCm-T質粒1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer1μL，T4 DNA Ligase 1μL，共10μL；連接條件：16℃過夜。

1.2.6 重組質粒的篩選及鑒定 各取5μL連接產物轉化100μL感受態細胞JM109，然后涂在含Amp、IPTG、X-gal的LB瓊脂平板上，37℃培養過夜。隨機挑取白色克隆提取質粒，同時以藍色質粒為對照。以白色重組質粒為模板做PCR（參照1.2.3），擴增、電泳回收目的片段，然后以膠回收產物為模板做PCR驗證（參照1.2.4）。

1.2.7 序列測定及序列分析 將新鮮菌液送金唯智生物科技（北京）有限公司進行目的片段的雙向測序，測序結果利用Vector NTI 9.0軟件進行序列拼接；序列的同源性比較用DNAMAN5.0軟件處理，并將翻譯后的氨基酸序列遞交至http：//swissmodel.expasy.org/tools/中進行Xyn ZF-1的氨基酸序列分析、二級結構預測及三維結構的同源建模。

2 結果與討論

2.1 木聚糖酶Xyn ZF-1 cDNA片段的擴增與克隆

圖1 Xyn ZF-1 cDNA的凝膠電泳Fig.1 Analysis of Xyn-ZF-1 cDNA fragment amplified by PCR

圖2 pUCm-T-Xyn ZF-1陽性克隆的PCR驗證Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by PCR

根據引物設計時參照Genbank中基因的大小和PCR擴增結果（圖1）割膠回收800bp左右的條帶（圖1第1泳道），利用T-A克隆策略將該cDNA片段直接克隆到pUCm-T vector中，連接轉化E.coli JM109，藍白斑篩選，挑取重組子，經PCR鑒定，證明所插入片段與擴增片段長度相同（圖2），送樣測定核苷酸序列。

2.2 木聚糖酶Xyn ZF-1 DNA片段的擴增克隆

圖3 Xyn ZF-1 DNA的凝膠電泳Fig.3 Analysis of Xyn-ZF-1 DNA fragment amplified by PCR

圖4 pUCm-T-Xyn ZF-1陽性克隆的PCR驗證Fig.4 Identification of the recombinant plasmid by PCR

根據目的基因的大小和PCR擴增結果（圖3）割膠回收800bp左右的條帶（圖3第1泳道），利用T-A克隆策略將該cDNA片段直接克隆到pUCm-T vector中，連接轉化E.coli JM109，藍白斑篩選，挑取重組子，經PCR鑒定，證明所插入片段與擴增片段長度相同（圖4），送樣測定核苷酸序列。

2.3 木聚糖酶Xyn ZF-1 cDNA片段的序列分析

圖5 黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-1 cDNA序列和推導的氨基酸序列Fig.5 Partial cDNA and deduced amino acid sequence of Xyn ZF-1 from Aspergillus niger

測序結果表明，RT-PCR產物全長確實為Xyn ZF-1 cDNA（圖5），該cDNA包含Xyn ZF-1信號肽編碼區，成熟肽編碼區，3’非編碼區和Poly（A）等核苷酸序列。該序列全長785bp（不包括Poly（A）），其中蛋白質編碼區678bp，編碼225個氨基酸，3’非編碼區107bp。根據cDNA序列推導出該木聚糖酶的氨基酸序列，共225個氨基酸，推測分子量為24.06ku，等電點為5.20，分子式C1065H1577N283O349S4。

2.4 木聚糖酶Xyn ZF-1 DNA序列分析

圖6 木聚糖酶Xyn ZF-1 DNA序列Fig.6 Xylanase Xyn ZF-1-encoding DNA

Xyn ZF-1序列包括起始位點、內含子和外顯子等核苷酸序列，全長746bp。該DNA序列與對應的cDNA進行序列對比分析，由圖6可知，在Xyn ZF-1 DNA編碼區僅存在一個內含子，長度為68bp。

2.5 黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-1與其他木聚糖酶一級結構的同源性比較

將黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-1成熟肽完整的氨基酸序列與Genbank中其他微生物來源的木聚糖酶一級結構進行同源性比較。結果表明，它與G/11族的木聚糖酶具有較高的同源性。圖7表明，Xyn ZF-1與Aspergillus usamii（Genbank登 錄 號 ：AEJ87263）、Chaetomium thermophilum（Genbank登錄號：CAD48750）、Holomastigotoides mirabile（Genbank登錄號：BAH56520）、Penicillium citrinum（Genbank登錄號：BAE71133）4種微生物中的木聚糖酶的同源性比對結果分別為89.47%、60.77%、56.94%、64.11%?？梢娡茖У哪揪厶敲赴被嵝蛄信cAspergillus usamii序列相似性最高，達到了89.47%。

圖7 微生物來源的木聚糖酶序列的多重比較Fig.7 Comparison of Xyn ZF-1to other microbial xylanase

2.6 木聚糖酶Xyn ZF-1的系統進化樹分析

將Xyn ZF-1成熟肽完整的氨基酸序列與從Genbank中隨機選取的13種木聚糖酶氨基酸序列進行系統進化樹分析（圖8），結果表明，它屬于G/11族糖基水解酶。

2.7 木聚糖酶XynZF-1二級結構分析及三維結構建模

圖8 木聚糖酶一級結構的系統進化樹分析Fig.8 Phylogenetic tree of xylanase gene based on amino acid sequnce annalysis

通過CFSSP（Chou&；FasmanSecondary Structure Prediction Server）方法分析得知，Xyn ZF-1二級結構主要由α-螺旋，β-折疊和少量轉角構成，所占比例分別為32.4%、46.7%和16.0%。三維結構建模顯示Xyn ZF-1具有G/11木聚糖酶典型的β-膠狀卷曲結構（圖9）。

圖9 通過SWISS-MODEL預測的Xyn ZF-1三維模型Fig.9 Three-dimensional structure of Xyn ZF-1 predicted by SWISS-MODEL

3 結論

3.1 以黑曲霉XZ-3S總RNA為模板，采用RT-PCR等技術分別擴增和克隆了木聚糖酶（Xyn ZF-1）cDNA的相關片段，經拼接獲得Xyn ZF-1 cDNA的完整序列，該cDNA全長785bp包含了起始密碼子、信號肽編碼區、成熟肽編碼區、終止密碼子和3’端非編碼區等核苷酸序列。

3.2 以黑曲霉XZ-3S基因組DNA為模板，采用PCR技術擴增和克隆了Xyn ZF-1的DNA相關片段，經拼接得到了Xyn ZF-1 DNA序列。該DNA全長746bp，包含起始密碼子、1個內含子和2個外顯子以及終止密碼子等核苷酸序列。內含子長度為68bp，位于Gln93第3個和Asp94第1個堿基之間。

3.3 一級結構和系統進化樹分析可知，該酶屬于G/11族，且與G/11族中的木聚糖酶有較高的同源性。二級結構預測該酶由許多α-螺旋、β-折疊和少量轉角構成。三維結構建模顯示Xyn ZF-1具有G/11木聚糖酶典型的β-膠狀卷曲結構。

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Cloning and sequence analysis of the gene encoding xylanase Xyn ZF-1 from Aspergillus niger XZ-3S

FU Guan-hua，LI Duan，ZHOU Chen-yan*
（Key Laboratory of Medical Genetics and Molecular Targeting Drugs，Xinxiang Medical College，Department of Life Science and Technology，Xinxiang 453003，China）

Q789

A

1002-0306（2012）16-0187-05

2012-01-11 *通訊聯系人

付冠華（1986-），男，碩士研究生，研究方向：微生物酶工程。

河南省教育廳自然研究計劃項目資助（2011A180026）；河南省科技廳科技攻關項目（112102210299）；新鄉醫學院研究生科研創新支持計劃項目（YJSCX201104Z）。