固態發酵結合酶解技術制備花生肽及其促生長活性的研究

楊 蘭

（廣東輕工職業技術學院，廣東廣州 510300）

固態發酵結合酶解技術制備花生肽及其促生長活性的研究

楊 蘭

（廣東輕工職業技術學院，廣東廣州 510300）

通過米曲霉固態發酵花生粕，結合酶解與冷凍干燥技術，制備花生肽。促生長實驗表明，以0.5%添加分子量小于3ku的花生肽對保加利亞乳桿菌的促生長作用更為明顯，其中乳桿菌的活菌數可提高1個數量級，凝乳效果改善，乙醛含量增加。比較氨基酸組成結果表明，該技術可有效提高氨基酸含量，改善氨基酸組成，乳桿菌生長必需的氨基酸含量達33.61～226.33mg/g。

花生肽，促生長，保加利亞乳桿菌，固態發酵

Abstract：Peanut peptide was made through solid state fermentation with Aspergillus oryzae on peanut meal and combination of enzymatic and freeze-drying technology.In the growth-promoting experiments，0.5%peanut peptide （Mw＜3ku） gave better activity on Lactobicillus bulgaricus，including that the number of viable cells raised by an order of magnitude，better coagulatin effects and increased acetaldehyde contents.Comparison of amino acid revealed that the contents and composition were improved through the method，including that the contents of essential amino acids（33.61～226.33mg/g） for Lactobacillus bulgaricus were observed.

Key words：peanut peptides；growth-promoting；Lactobacillus bulgaricus；solid-state fermentation

花生是最重要的油料作物之一，榨油后產生大量的花生粕其中蛋白含量達45%以上[1]。但由于花生蛋白易嚴重變性，且具有氨基酸構成不太平衡、易受黃曲霉毒素污染等問題，花生粕大多數都被作為飼料使用[2]。生物活性肽對微生物的促生長作用日益受到關注[3-4]，其制備方法主要包括外加酶解、微生物發酵等。與外加酶解法用酶單一、成本較高、產物苦味難以消除、液態發酵法投入成本大、排放污水多[5]相比，固態發酵使用的基質含水量低，不需要廢水處理，并且直接利用微生物代謝產生的綜合酶系，可大大降低生產成本，其發酵過程也不需要嚴格的無菌操作，具有明顯優勢[6]。同時米曲霉是一種易培養、產復合酶的菌株，具有高強度啟動子、很強的蛋白分泌能力[7]，其細胞內滲透壓較高，在固態發酵中的應用較其他菌種更為廣泛[8-9]。本次研究首先通過米曲霉固體發酵花生粕，利用代謝產生的以蛋白酶為主的綜合酶系直接酶解花生粕，制得具有生物活性的花生肽，并進一步研究花生肽對保加利亞乳桿菌的促生長作用，以提高花生粕的附加值，為制備高質量的花生粕促生長肽提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉（Aspergillus oryzae）M-11、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus） 廣東輕院微生物實驗室提供；MRS液體培養基 葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，牛肉浸膏10g，乙酸鈉5g，吐溫80 1g，檸檬酸二銨2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO42.0g，MnSO4·4H2O 0.05g，加水至1000mL，121℃滅菌15min；桿菌計數培養基[10]蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，吐溫80 1g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20.0g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，瓊脂15g，溶于1L蒸餾水中，調節pH5.4，過濾攪拌加熱至沸，分裝試管，121℃滅菌15min；脫脂復原乳 乳固體含量11%；花生粕 山東魯花集團。

LG10-2.4A高速離心機 北京京立離心機有限公司；FD-4冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；BT00-300M蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司；Vivaflow 200超濾裝置 美國Vivascience公司；瑞利UV1801紫外可見分光光度計 北京瑞利公司；Agilent 1100液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗條件 色譜條件 PICO TAG氨基酸分析柱；柱溫40℃；洗脫液A pH6.4醋酸鈉緩沖液；洗脫液B 60%（v/v）乙腈；流速1.0mL/min；檢測波長254nm。

1.2.2 工藝流程 制備米曲霉孢子懸液→制備種曲→制備花生粕曲→水解→膜分離、凍干得花生肽粉

1.2.3 操作要點

1.2.3.1 制備孢子懸液 將10mL無菌水加至30℃培養3d的豆汁斜面，用已滅菌的接種環在培養基表面輕輕刮動，制成孢子懸液，混勻后用血球計數板計孢子數，調整孢子懸液的孢子數為5.0×106個/mL。

1.2.3.2 制備麩皮種曲 麩皮100g及水100mL，拌勻后分裝于250mL三角瓶中，添加1.00%葡萄糖、0.10%氯化鈣、0.05%硫酸鋅、3.00%豆粕，每瓶20g（約1～2cm厚），121℃滅菌20min，趁熱打散，降至室溫后接種孢子懸液，于28～30℃培養72h。

1.2.3.3 制作花生粕曲 稱取1000g花生粕（潤水、蒸煮并放涼至40℃左右）、0.75g種曲、100g麩皮，完全混勻，于32℃、RH 90%～95%條件下分別培養28、32、36、40、44h，測定花生粕曲蛋白酶活，以U/g花生粕曲干重表示。

1.2.3.4 花生粕曲水解 將培養好的花生粕曲打散，加入相當于花生粕曲4倍重量的水，于55℃水解9h，每隔1h測定花生肽得率。

1.2.3.5 膜分離與冷凍干燥 將水解液進行膜分離，其中膜的截留分子量為（Molecular Weight cut Off）10、3ku，蠕動泵（BT00-300M）轉速為30r/min，共收集得到三個組分，即組分Ⅰ（Mw＞10ku）、Ⅱ（10ku＞Mw＞3ku）、Ⅲ（Mw＜3ku）。將各組分冷凍干燥后得花生肽粉，密封保存于4℃冰箱內

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 蛋白酶活的測定 采用福林酚試劑法[11]。

1.2.4.2 花生肽得率的測定 以三氯乙酸（TCA）氮溶解指數表示[12]，計算公式見式（1）：

式中：N1──水解液在10%TCA中可溶性氮的含量，mg；N0──水解液中總氮的含量，mg。

1.2.4.3 OD值的測定 以生理鹽水為調零基準，用UV1801型分光光度計于波長625nm測發酵液OD值。

1.2.4.4 pH的測定 用pHS-25型酸度計測定發酵液pH，每次使用前用pH6.86和pH4.00標準緩沖溶液校準酸度計。

1.2.4.5 活菌數的測定 桿菌以3%接種于脫脂復原乳培養基中，于42℃恒溫培養。在無菌操作條件下，將發酵液充分混勻，移取1mL發酵液及9mL稀釋液（0.1%胰蛋白胨溶液）置于試管內，并在渦流儀上充分混勻，依次做10倍遞增稀釋至合適的稀釋度（預實驗確定）。吸取1mL稀釋后的發酵液于滅菌計數培養基中，做三個平行樣，在37℃恒溫培養箱中培養72h計數。

1.2.4.6 乙醛含量的測定 取發酵液40mL，加入等體積16%三氯乙酸溶液，以轉速3500r/min離心10min，過濾后得待測上清液。精確量取1%NaHSO3溶液5.00mL置于錐形瓶中，加入待測上清液25mL，搖勻，室溫放置1h后，加入1%淀粉溶液1mL，用0.1mol/L碘液滴定至近終點時，用0.01mol/L碘液滴定至淺藍紫色。再加1mol/L NaHCO3溶液20mL，振蕩混勻0.5min，用0.01mol/L碘（1/2 I2）標準溶液滴定至淡藍紫色，記錄消耗的標準碘液體積，同時用脫脂復原乳做空白試驗，每樣品至少做3次平行滴定，取平均值。計算公式見式（2）：

式中：V（1/2I2）——滴定上清液時消耗碘（1/2 I2）標準溶液的體積，mL；V0——空白滴定時消耗碘（1/2 I2）標準溶液的體積，mL；C（1/2I2）——碘（1/2 I2）標準溶液的濃度，mol/L。

1.2.4.7 雙乙酰含量的測定 將11%的脫脂復原乳121℃滅菌7min后迅速冷卻，用于配制濃度分別為0、10、20、30、40、50mg/L的雙乙酰標準液。取各濃度標準液按如下方法操作，繪制標準曲線：加等體積的16%三氯乙酰溶液，混勻，以轉速3500r/min離心10min，取上清液20mL分別加入到2支（1號和2號）試管中，向1號管中加入1%的鄰苯二胺溶液0.5mL，2號管不加，搖勻后置于黑暗處放置30min，然后各加入4.0mol/L HCl溶液2.0、2.5mL以終止反應，混勻后以不加鄰苯胺的2號管的溶液作為參比液，用紫外-可見分光光度計在335nm波長下測定吸光度值，每樣至少做2個平行，取平均值，然后以雙乙酰濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。用發酵液代替脫脂復原乳，測定發酵液中雙乙酰濃度。

1.2.4.8 氨基酸組成的測定 用6mol/L鹽酸溶液水解待測樣品，0.45μm微濾膜過濾，Agilent 1100液相色譜儀測定樣品氨基酸組成。

2 結果與討論

2.1 花生肽的制備

2.1.1 不同培養時間對成曲蛋白酶活的影響 花生粕曲的制作時間應根據所用菌種、制曲工藝來決定。在本次研究中采用米曲霉，其最適生長溫度為32～35℃，溫度過低則低溫型微球菌、毛霉菌等容易生長；溫度過高則枯草芽孢桿菌、根霉等耐高溫的微生物容易生長繁殖，產生氨味。另外，考慮到成曲制作時，曲料的厚度會使得制曲過程中放出的熱量不能及時排出，并結合筆者前期對米曲霉制曲的研究經驗，選用32℃進行培養，結果如圖1所示。

圖1 制曲時間對花生粕曲中性及酸性蛋白酶活的影響Fig.1 Effect of koji-making time on neutral and acidic protease activity of peanut meal koji

2.1.2 不同水解時間對花生肽得率的影響 米曲霉代謝生成的蛋白酶最適水解溫度為50～55℃，且在適宜溫度范圍內，較高的溫度有助于提高水解的速度，因此將制好的花生粕曲加相當于4倍重量的水于55℃進行水解，觀察其花生肽得率的變化情況，實驗結果見圖2。

圖2 水解時間對花生肽得率的影響Fig.2 Effect of hydrolyzing time on peanut peptide yield

圖2中可以看出，隨著水解時間的增加，TCA-NSI逐漸增加，在7h達最大值88.45%。在水解時間超過7h后，花生肽得率保持相對穩定的狀態，這是因為隨著水解底物蛋白的減少，生成的花生肽逐漸增加，抑制了水解反應，甚至會出現部分水解產物又重新聚合的現象。TCA-NSI的高低反映了水解產物的生化特性及肽鏈的長短，一般認為TCA-NSI值越大，肽鏈越短。因此選取7h作為花生肽制備的水解時間。

2.2 不同分子量范圍的花生肽對MRS培養基中乳桿菌生長的影響

將保加利亞乳桿菌按3%（v/v）接種于含有不同分子量段花生肽的MRS液體培養基中，37℃有氧培養24h，在625nm下測量培養基的OD值與pH，結果如圖3所示。

由圖3可知，與對照組相比，不同分子量范圍的花生肽均使得OD值提高、pH下降。添加組培養基OD值增加至0.95～1.12，對于蛋白分解能力較弱的桿菌而言，在MRS培養基中添加富含肽的蛋白水解物，作為乳桿菌生長過程中所需的氮源，是能夠促進乳桿菌增殖和發酵的有效途徑。另外，添加花生肽也使培養基的pH下降較對照組更為明顯，原因可能是由于氮源利用效率提高，乳桿菌活力增強導致產酸能力增強，同時乳桿菌總量的增加也導致總酸量的增加。

圖3 不同分子量花生肽對保加利亞乳桿菌生長的影響Fig.3 Effect of peanut peptides with different moleculer weight on growth of L.bulgaricus in MRS

圖3表明，分子量小于3ku的花生肽對培養基的OD值、pH的影響相較其他分子量范圍的肽更為明顯。近年來，研究發現不同分子量肽段對微生物的促生長作用有明顯差異，如St-Gelais等[13]報道肽鏈的長短是決定肽促乳酸菌生長活性強弱的一個重要因素，Proulx等[14]發現分子量小于2ku的肽段對于B.ifidubactreia的生長最為有利，王洪榮[15]認為分子量小于3ku的魚粉肽和豆粕肽對瘤胃細菌和原蟲的生長有促進作用，能提高瘤胃中的蛋白酶活。因此，將以分子量小于3ku的花生肽作為下一步研究對象。

2.3 花生肽添加量對發酵乳的影響

分別添加0、0.2%、0.5%、1.0%、1.8%、3.0%花生肽于脫脂復原乳中，接種保加利亞乳桿菌，于42℃培養，觀察凝乳時間和凝乳效果，測定凝乳時活菌數，結果如表1所示。

表1 不同添加量對脫脂復原乳中活菌數及凝乳效果的影響Table 1 Effect of different amounts on the number of viable cells and coagulating in reconstituted skim milk

表1表明，隨著花生肽的添加，脫脂復原乳培養基出現活菌數增加、凝乳時間縮短及凝乳效果增強的現象，這主要是由于隨著生成的乳酸增加，pH下降較快，以致α-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白都傾向于從酪蛋白膠束中解離出來，疏水作用的排斥作用減少，酪蛋白膠粒開始凝聚沉降，出現凝乳現象。在添加量大于0.5%后，活菌數的增加變得緩慢，凝乳時間的變化也不明顯，但出現酸乳黏度下降的現象，可能是隨著pH進一步下降及乳桿菌對蛋白分解作用的增強，微小蛋白質亞膠體分子團之間的親合連接作用減弱，導致酸乳膠體的剛性降低，出現由膠體分子團聚集形成的蛋白質網絡松散、酸乳黏度降低的現象[16]。

There is also a series of iconic Chinese sculptures as horses, warriors or animals out of fairy tales. These are bronze sculptures partly covered by enamel in different colors. These arte facts are fascinating for those who still can believe in a romantic way of day dreaming.

發酵乳中生成上百種揮發物，Friedrich等[17]研究表明乙醛和雙乙酰是對風味影響最大的物質。本實驗對發酵乳中的乙醛和雙乙酰含量進行測定，結果如圖4所示。

圖4 花生肽對脫脂復原乳發酵液風味物質的影響Fig.4 Effect of peanut peptide on volatile components in fermented milk

乙醛的生成主要通過Threonine aldolase途徑，將蘇氨酸轉變成甘氨酸和乙醛，添加組中可能由于花生肽的水解等原因使蘇氨酸含量增加[18]，乙醛含量達20～25μg/mL，對生成乙醛有一定的促進作用。雙乙酰含量則由糖代謝生成的丙酮酸或乳中所含檸檬酸來決定，由圖4可以看出，保加利亞乳桿菌發酵生成雙乙酰的能力明顯低于乙醛，且肽的添加也未帶來明顯變化。

對于發酵乳風味而言，雙乙酰和乙醛的比例對酸奶的風味影響也很大，如Zouari等[19]認為兩者比例為1∶1時，具有典型酸奶風味，而Bottazzi[20]認為乙醛與丙酮比例為2.8∶1時，可獲得所期望的濃郁風味。實際上國內外學者對于產生酸奶最佳風味所需各物質的濃度和比例進行了大量的探索，但目前尚未取得一致結論[21]。本次研究中兩者比值均大于1，這也與發酵時僅使用了單一菌種（保加利亞乳桿菌）且保加利亞乳桿菌產雙乙酰的能力較差有關?？紤]到酸奶實際生產與冷藏期間，由于多種微生物的持續作用，其風味物質的含量和比例還會繼續變化，對風味的最終影響還有待于進一步研究。

2.4 花生肽對脫脂復原乳中保加利亞乳桿菌生長代謝規律的影響

將桿菌以3%接種于含0.5%花生肽的脫脂復原乳培養基中，在42℃恒溫培養，并分別于0、4、8、12、16、20h取發酵液，觀察保加利亞乳桿菌的生長代謝規律，測定發酵液中活菌數、pH，結果如圖5所示。

由圖5可知，隨著保加利亞乳桿菌發酵的進行，添加組的保加利亞乳桿菌增殖速度明顯變快，發酵4h后，添加組與對照組的活菌數差異較明顯，之后始終高于對照組0.5～1個數量級。

圖5 花生肽（Mw＜3ku）對保加利亞乳桿菌生長代謝的影響Fig.5 Effect of peanut peptides with Mw＜3ku on growth of L.bulgaricus

保加利亞乳桿菌為化能異養型微生物，營養要求較為苛刻，需要寡肽、氨基酸、維生素和嘌呤等物質及其它生長因子才能獲得良好生長。保加利亞乳桿菌利用外加氮源主要發生在對數增長期，此時添加了肽的培養基中氨基酸和寡肽處于較高水平，對乳桿菌生長表現出明顯的刺激作用。隨著乳桿菌的生長，細胞數量的增加，菌株水解脫脂復原乳中的蛋白質釋放出氨基酸及寡肽，pH也隨著其主要代謝產物乳酸的累積而迅速下降。但由于肽的添加，將緩解發酵液的pH下降趨勢，20h左右添加組與對照組的pH差別縮小。

2.5 花生肽的氨基酸組成

花生肽主要是由寡肽和部分游離氨基酸組成的混合物，既可為乳桿菌生長提供氨基酸來源，又能夠從培養基中以肽轉運的方式進入細胞以促進生長。將花生肽與花生粕中的氨基酸進行比較，結果如表2所示。

由表2可知，經過水解后，花生肽中各種氨基酸含量均有所提高，氨基酸比例適當，并且乳桿菌生長必需的谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸含量較高，在226.33mg/g與33.61mg/g之間，是促進保加利亞乳桿菌增殖的有效氮源補充物?？蔀槿闂U菌生長提供很好的短肽和氨基酸來源，可以認為固態發酵結合酶解技術是提高花生蛋白氨基酸含量的有效途徑之一。

但需要指出的是，乳酸菌的蛋白質水解系統由胞處定位的絲氨酸蛋白酶、肽轉運系統和部分胞內肽酶組成，寡肽的運輸是氮源進入細胞內的主要途徑之一，如白鳳翎[22]的研究發現以分子量小于5ku的大豆蛋白水解物代替全價氨基酸可以使保加利亞和乳桿菌細胞密度增加到5倍，最大增長速率增大1倍，因此研究花生肽（尤其是短肽）的組成與氨基酸序列對保加利亞乳桿菌促生長的影響將成為下一步工作的主要目標。

表2 花生肽（Mw＜3ku）與花生粕的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of peanut meal and peanut peptide（Mw＜3ku）

3 結論

3.1 研究了利用米曲霉固體發酵花生粕，產生以蛋白酶為主的綜合酶系后，加水至花生粕曲中，確定花生粕曲的制作時間為36h。利用粕曲自身產生的蛋白酶進行水解花生粕蛋白，確定水解溫度為55℃，水解時間為7h。將水解液按分子量進行分離后，冷凍干燥得花生肽，本工藝具有成本低、廢液少、易操作等優點。

3.2 分子量范圍在小于3ku的花生肽，用量為0.5%時促生長的效果最好，其生長曲線表明，活菌數比對照組增加1個數量級，pH下降速度增加，對風味物質如乙醛的生成也有一定的促進作用。

3.3 氨基酸測定結果表明，花生肽中氨基酸比例適當，其中乳桿菌生長必需的氨基酸如天門冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等含量較高，是促進增殖的有效氮源補充物。

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Study on peanut peptides preparation through solid-state fermentation combined with enzyme hydrylyzing and growth-promoting activity

YANG Lan
（Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China）

TS201.3

A

1002-0306（2012）16-0199-05

2012-05-07

楊蘭（1974-），女，博士，講師，研究方向：食品生物技術。