大豆果膠類多糖組成特性及空間結構的初步解析

劉 賀 郭曉飛 劉俊山 李 君 朱丹實

(渤海大學化學化工與食品安全學院 遼寧省食品安全重點實驗室遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”，錦州 121013)

大豆種皮因含有豐富的果膠類多糖而備受關注［1］。國內外諸多學者對大豆皮多糖產生濃厚興趣，已在多糖提取工藝的優化及初步理化性質分析方面做了大量工作。周艷紅等［2］對從大豆皮中提取果膠多糖的工藝條件進行了研究，通過單因素法和正交試驗，得到草酸銨濃度為0.6%，料液比為1∶35，萃取時間為2 h，萃取溫度為100℃，提取率可達6%。Proctor課題組采用酸法提取大豆皮果膠并探討了乙醇沉淀方法對果膠純度和產率影響，果膠的提取率達到15%左右，半乳糖醛酸質量分數在60%～85%左右［3－4］。本課題組前期在大豆果膠多糖提取工藝的優化并采用果膠甲酯酶對大豆皮果膠浸提液進行脫酯處理的基礎上，利用均勻設計方法考察酶解溫度、酶解時間、pH和酶的加入量對果膠產品酯化度和果膠提取率的影響，獲得了具有統計學意義的二次回歸方程［5］，利用其凝膠性能將保加利亞乳桿菌包埋，考察不同凝膠組成對菌株的包埋率及其在人工胃液中的存活情況以及在人工腸液中的釋放情況，結果表明，果膠凝膠包埋保加利亞乳桿菌，可以有效保護益生菌，并在人工腸液中將其釋放，果膠質量分數及氯化鈣濃度對包埋效果有影響，體現在二者交聯形成網絡結構的差異，網絡結構越致密，包埋率及益生菌在人工胃液中的存活率越高，而釋放率則越低［6］。劉賀等［7］考察色素在低甲氧基大豆皮果膠和殼聚糖復合凝膠中的擴散行為，結果表明，一級動力學方程較好地描述了色素在復合凝膠溶脹狀態下的擴散過程。并利用均勻設計方法獲得了表觀速率常數及擴散系數的多元二次回歸方程，合理地表征了各因素對動力學參數的影響情況，擴散動力學參數反映了凝膠網絡結構的特征。但目前尚缺乏大豆果膠類多糖結構方面的研究。

為獲得大豆果膠類多糖更為豐富的信息，從而為明晰大豆果膠類多糖結構與凝膠特性之間的關系奠定理論基礎，本研究首先對多糖進行凝膠層析分離，進而開展對多糖層析分離，對各組分多糖的一級結構進行初步探討，并利用光散射(LS)和透射電鏡(TEM)對各組分進行分子質量及空間結構信息分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆果膠類多糖，實驗室制備，總糖82.36%，蛋白質 5.21%，水分 6.84%，灰分 5.59%。DEAE －Sepharose FF、標準分子質量的Dextran、標準單糖:美國pharmacia公司。

1.2 儀器與設備

HL－2B恒流泵、BSZ－100自動部份收集器:上海青浦滬西儀器廠;SZ－93A自動純水蒸餾器:上海亞榮生化儀器廠;Waters600高效液相色譜儀:美國Waters公司;DionexICS－5000離子色譜儀:美國戴安公司;T6700傅里葉紅外光譜:美國NICOLE公司;H－800透射電子顯微鏡:日本理學公司;DAWN HeleosII多角度光散射檢測儀:美國懷雅特技術公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆果膠類多糖的分離

稱取50 mg大豆果膠類多糖溶解于25 mL 0.02 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液中，采用DEAE Sepharose FF陰離子凝膠對多糖進行分離純化，色譜柱為1 cm×60 cm，柱床高度約 45 cm，先用 0.02 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液洗脫，再用含有0～1 mol/L NaCl的0.02 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液進行梯度洗脫，平均流速2.5 mL/min，每2 min接收1管，利用苯酚硫酸法(490 nm)和紫外吸收法(280 nm)跟蹤檢測多糖和蛋白，得洗脫曲線，收集洗脫峰、旋轉蒸發、濃縮、透析、干燥得到多糖組分［8］，分別記為SHPPN(SHPP－中性組分)和SHPP－A(SHPP－酸性組分)。

1.3.2 單糖組成分析

多糖溶于4 mol/L的TFA中，110℃烘箱中水解6 h，反復加入甲醇利用氮吹儀使之吹干，用去離子水稀釋20倍，通過高效離子色譜分析其單糖組成。色譜柱為Carbopac PA20 column(150 mm×3 mm);流速:0.5 mL/min;進樣量:25 μL;檢測器:脈沖安培檢測器，金電極;前20 min NaOH溶液濃度為4 mmol/L，之后為160 mmol/L進行洗脫［9］。

1.3.3 尺寸排阻色譜法(SEC)和激光光散射(LS)聯用分析

SHPP－N和 SHPP－A溶于0.2 mol/L NaNO3中，過0.22 mm微濾膜后，利用尺寸排阻色譜法(SEC)和激光光散射(LS)聯用測定SHPP－N和SHPP－A的相對分子質量和構象參數，用標準相對分子質量的Pullulan(7.0×104和2.0×106)校正。色譜柱為 TSKgel G4000 PW XL 7.8 ×300，樣品池為 K5，流速0.5 mL/min，淋洗液為 0.2 mol/L NaNO3(折光指數 n=1.334)，RI檢測器和 LS 檢測器聯用［10］。

1.3.4 傅里葉紅外光譜(FT－IR)分析

樣品測試前空白校正，扣除空氣中CO2和濕度對樣品測定的干擾，空白掃描32次以上，分辨率為1 cm－1，掃描范圍400～4 000 cm－1。然后對干燥、研磨后的多糖樣品進行IR掃描。

1.3.5 透射電鏡(TEM)分析

取SHPP－N和SHPP－A分別配制成10 μg/mL的分散液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，把多糖溶液涂在碳膜的銅網上，自然干燥后經磷鎢酸負染色后，用TEM觀察多糖的分子形貌［11］。

2 結果與討論

2.1 SHPP的組成及初步分離純化

試驗所用原料為微波輔助從大豆種皮中提取得到的果膠類多糖［12－13］。從所帶電荷來看，果膠類多糖一般包含中性糖組分及酸性糖組分。圖1為大豆種皮多糖溶液的洗脫曲線，DEAE－Sepharose FF為陰離子瓊脂糖凝膠，兼具有電荷效應和分子篩效應，可把組分依電荷和分子質量進行分離，經層析分離后，SHPP分為兩個組分，即SHPP－N和SHPP－A(圖1)，前者占33.46%，后者占66.54%。并且第一個組分無紫外吸收，第二個組分有紫外吸收，并且酸性糖部分與紫外吸收峰值基本吻合。同時采用福林酚法對多糖的蛋白含量進行測定，表明SHPP－A中蛋白質質量分數為7.16%，糖蛋白使多糖與蛋白值以共價鍵形式結合緊密結合在一起，在圖1中SHPP－A與蛋白質洗脫曲線的重合表明它們之間的緊密聯系，初步分析其為一種糖蛋白。鄭建仙等［14］采用NaClO3和 HOAc對大豆細胞壁物質進行提取，獲得一種含羥脯氨酸的糖蛋白(PRF3)，采用DEAE－Sephadex A－50對提取物進行分離，并利用化學方法其精細結構進行解析，表明其主鏈為半乳糖，支鏈為阿拉伯糖。SHPP－A與PRF3在提取方法和原材料上存在差異，但從組成上看，二者存在一些共性與聯系。

圖1 SHPP在DEAE－Separose FF凝膠下洗脫曲線

2.2 SHPP－N和SHPP－A的單糖組成

利用離子色譜對SHPP－N和SHPP－A單糖組成進行分析，圖2a～圖2c分別為12種標準單糖、SHPP－A和SHPP－N離子色譜圖。SHPP－N和SHPP－A單糖組成的物質的量比如表1所示，經過DEAE－Sepharose FF分離后，SHPP－A中半乳糖醛酸質量分數達40%，而SHPP－N以甘露糖為主，二者的半乳糖含量比較接近。賴富饒等［15］采用熱水浸提豆皮水溶性多糖，利用DEAE－cellulose對粗多糖進行分離，得到SHP－3，利用氣相色譜測定其糖醛酸質量分數為26.71%，鼠李糖∶果糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖的物質的量比分別為3.55∶0.44∶11.58∶1.745∶5.12∶1.12，且沒有紫外吸收，其結構與SHPP－A組成存在顯著差異，從組成上來看，其為一種類似瓜爾膠的半乳甘露聚糖。

表1 SHPP－N和SHPP－A單糖物質的量比

2.3 紅外分析

利用FT－IR可以對大分子結構進行初步表征，圖3為SHPP－A和SHPP－N的FT－IR圖譜，2 500～3 700 cm－1為O—H伸縮振動的強吸收峰，由分子間和分子內的氫鍵所引起，2 930 cm－1為C—H的伸縮和彎曲振動，在2 700～3 000 cm－1它與O—H重疊在1 000～2 000 cm－1為果膠類多糖的特殊吸收峰，1 740 cm－1為果膠類多糖自由羧基的吸收峰［16］;SHPP－A在1 100～930 cm－1有3個吸收峰，表明SHPP是以吡喃環為主，SHPP－A在889 cm－1和833 cm－1吸收峰表明既有β－型糖苷鍵又有α－型糖苷鍵［17，18］;且在 1 418 cm－1有蛋白質高級結構 β折疊所引起的紅外吸收，表明SHPP－A還有一定量的蛋白，與DEAE－Sapharose FF紫外吸收呈現出一致性。相比之下SHPP－N在876.6 cm－1附近的吸收峰表明SHPP－N為β－糖苷鍵結構，且不含蛋白吸收峰。從DEAE－Sepharose FF對多糖進行分離，并利用紫外跟蹤檢測的結果來看，SHPP－A與蛋白質結合在一起，IR結構分析驗證了上述試驗結果。

圖3 SHPP－A和SHPP－N的紅外吸收

2.4 多糖的分子質量及分子尺寸

SEC與LS聯用技術主要是利用RI和LS兩個檢測器對高分子分級、檢測，可對高聚物分子質量分布和均方旋轉半徑(＜s2＞1/2)進行測定，Berth利用Sepharose 2B和Sepharose 4B對商業桔皮果膠進行分離，分別采用光散射法和固有黏度法對各組分相對分子質量進行測定［19］;表2為SEC－LS聯用所測得的相對分子質量和分子尺寸參數，高分子一般呈現出多分散性，Mw為重均相對分子質量，Mn為數均相對分子質量，Mz為Z均相對分子質量;表2所示為SHPP－N和SHPP－A的相對分子質量分布參數，SHPP－N的相對分子質量分布指數為1.756，呈現一定的多分散性，而SHPP－A的相對分子質量分布指數為 1.092，呈現單分散齊聚物的特性，表明經DEAE－Sepharose FF凝膠分離后，相對分子質量呈現均一性。均方旋轉半徑表示高聚物在溶液中平均尺寸，可以反映高聚物伸展狀態的構象;從表2中可以看到SHPP－N和SHPP－A的分子尺寸較為接近，SHPP－A的部分伸展程度大于AHPP－N。

表2 SHPP－N和SHPP－A相對分子質量與分子構象參數

2.5 TEM 分析

TEM利用電子聚焦成像的高分辨率和高放大倍數的光學儀器［20］?？蓪ι锎蠓肿咏Y構進行解析，戴玲等［21］利用TEM對丹皮多糖結構進行研究，表明丹皮多糖以球狀和圈狀為主，可進一步聚集為鏈狀和網狀。圖4a為SHPP－A的TEM成像圖，多糖鏈有數百納米的長度，多糖鏈之間通過氫鍵等次級鍵形式交聯在一起形成聚集體，呈纖維狀，Humblet－Hua利用卵清蛋白和果膠的聚電解質作用的制備微膠囊壁材，TEM對其結構分析表明它的幾何尺寸與SHPP－A較為相似，但呈現出球狀結構［22］。圖4b為SHPP－N在水溶液中呈現的桿狀結構，SHPP－N分子沒有聚集現象，分子幾何尺度的伸展較小，這與SEC－LS聯用對SHPP－N和SHPP－N構象參數測定的結果較為吻合。

3 結論

SHPP－N以中性糖為主，SHPP－A是以酸性糖為主的糖蛋白。SHPP－N和SHPP－A重均相對分子質量分別為2.293×105和4.094×105。SHPP－N的相對分子質量分布指數為1.756，呈現一定的多分散性，而 SHPP－A的相對分子質量分布指數為1.092，呈現單分散齊聚物的特性，相對分子質量分布較為均一。初步推測SHPP－N和SHPP－A空間構象為桿狀，并且SHPP－A分子以次級鍵交聯，較SHPP－N更具柔性和伸展性。因此酸性多糖具有更好的透明度，應用前景更為廣泛。

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