響應面法優化填充床反應器固定化酶催化制備MLM型結構脂質

潘向昆 王瑛瑤 魏翠平 欒 霞 劉建學 段章群 侯冰冰

(河南科技大學食品與生物工程學院1，洛陽 471003)

(國家糧食局科學研究院2，北京 100037)

結構脂質(structured lipids，SLs)是天然油脂改性的一類特殊的脂肪。其通過一些條件(通常情況下是脂肪酶)來改變天然脂質中脂肪酸的組成和位置，將某些特殊營養或者生理功能脂肪酸結合到特定位置，最大程度發揮合成脂質中各種脂肪酸的功效，因此結構脂質又名重構脂質［1］。廣義上的結構脂質是指經過重構天然脂質中甘三酯脂肪酸所在位置和組成改變，即天然油脂的改性產品，天然油脂的風味和物性改變較少，保持了其在食品應用的原來特性［2］。前人曾根據定位在甘油骨架脂肪酸將結構脂質分為定向結構脂質(SSL)和隨機結構脂質(SL)，定向結構脂質主要是指長鏈脂肪酸位于甘油骨架的Sn－2位，中鏈或短鏈脂肪酸位于Sn－1，3位的結構脂質(MLM型結構脂質)［3］。

三酰甘油骨架上的脂肪酸消化吸收代謝有特定的生理特點，機體內的脂肪酶水解Sn－1，3位脂肪酸，以游離脂肪酸的形式被吸收，而Sn－2位脂肪酸則以單甘酯的形式被吸收［4］。以1，3特異性固定化脂肪酶催化中碳鏈脂肪酸辛酸制備的MLM型結構脂質，具有快速消化吸收代謝等特點，從而為特定人群快速提供能量，而且代謝后在體內蓄積少，中鏈脂肪酸和相同質量的長鏈脂肪酸相比產生的能量較少，因此還具有減肥等功效［5］。

采用填充床反應器固定化酶催化制備MLM型結構脂質，具有反應條件溫和、副產物少且產物便于回收［6］。固定化酶在結構脂質的制備上不僅具有特異性和專一性，而且增加酶的使用壽命，便于條件的調控。本試驗以菜籽油和辛酸為底物，采用響應面試驗設計和分析方法對影響固定化脂肪酶在填充床中酶催化制備MLM型結構脂質的因素進行研究，以期得到最佳制備條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽油:市購;辛酸、正己烷、異丙醇、乙酸乙酯及丙酮:均為色譜純，Sigma－Aldrich公司;固定化脂肪酶:Novozyme公司;其他試劑均為分析純:北京化工廠。

Waters Acouity型超高效液相色譜儀(配ELSD檢測器):美國Waters公司;R－215型旋轉蒸發儀:BUCHI公司;2005－02型低速離心機:國華機械有限公司;DK－S24型電熱恒溫水浴鍋:上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 固定化酶催化制備MLM型結構脂質

將水分質量分數調到預增加值后的酶裝入固定床反應器，按一定比例稱取底物菜籽油與辛酸混勻置于反應器，將底物泵入固定床反應器，控制反應時間，制備混合產物。

1.2.2 MLM型結構脂質的純化

酶催化酸解反應是在中碳鏈脂肪酸過量的條件下進行的，得到的產物體系中存在大量的酸，在酶催化酸解反應過程中除了生成不同類型(諸如MMM、MLM、LLM、LLL)的結構脂質以外，還會產生少量甘一脂、甘二脂等中間副產物。因此需要將產物進行純化。

稱取酶催化酸解產物，按酸解產物/乙醇水溶液1∶3比例加入乙醇水溶液(乙醇水體積比70∶30)，劇烈搖勻15 min，3 500 r/min離心20 min，靜置15 min，分離出油相，重復3次，將最終得到的樣品溶于適量正己烷中，加入2滴酚酞，用0.5 mol/L的KOH乙醇水溶液(乙醇水體積比30∶70)滴定至乙醇水溶液變紅，靜置5 min，分離正己烷，加入無水硫酸鈉出水后旋蒸得到結構脂質。

1.2.3 超高效液相色譜分析方法

樣品制備:稱取1.2.2所得結構脂質 100 mg，置于5 mL容量瓶中用丙酮定容。過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜后取0.2 μL進UPLC(超高效液相色譜)分析。

1.2.4 超高效液相色譜分析條件［7］

采用 BEH C18 柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);流動相:丙酮/乙腈(體積比65∶35);ELSD溫度:40℃;氮氣壓力:2.1 MPa。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 反應時間的影響

圖1 反應時間對酶催化酸解制備MLM型結構脂質含量的影響

在酶量為10 g(水分質量分數為0.15%)，底物物質的量比(菜籽油/辛酸)為1∶4，反應溫度為60℃條件下，考察反應時間對酶催化酸解反應的影響，結果見圖1。從圖1可以看出，隨反應時間的增加，MLM型結構脂質物質的量分數逐漸升高，反應時間為2 h時，MLM型結構脂質含量基本不變，反應達到平衡。隨著延長反應時間，MLM型結構脂質的含量雖然有所增加，但是增幅較緩，考慮到試驗成本、時間成本和MLM型結構脂質含量增加量等各因素，選擇反應時間為2 h較優。

2.1.2 底物物質的量比的影響

在加酶量為10 g(水分質量分數為0.15%)，反應溫度為55℃，反應時間為2 h的條件下，考察底物物質的量比對酶催化酸解反應的影響，結果見圖2。從圖2可以看出，隨著底物物質的量比增大，MLM型結構脂質含量逐漸升高，符合反應方程動力學，反應物的增加會使方程向產物增加的方向進行。隨著底物物質的量比繼續增大，酶的催化效率會受到影響，一方面底物的增多會導致酶的競爭性抑制，另一方面在本試驗中過多的辛酸會導致反應體系酸值較低，會導致酶活的降低甚至失活［8］。綜合考慮酶的使用壽命和后續對產物的分離純化，選擇菜籽油辛酸底物物質的量比1∶4。

圖2 底物物質的量比對酶催化酸解制備MLM型結構脂質含量的影響

2.1.3 反應溫度的影響

在加酶量為10 g(水分質量分數為0.15%)，底物物質的量比為1∶4，反應時間為2 h的條件下，考察反應溫度對酶催化酸解反應的影響，結果見圖3。從圖3可以看出，隨著反應溫度的升高，MLM型結構脂質的含量也隨之增加，在溫度為55℃時反應體系中的MLM型結構脂質含量達到平衡，隨著溫度的繼續升高，MLM型結構脂質的含量會有所降低，這也說明溫度是影響?；D移的主要因素［9］?？紤]到連續試驗遇到的酶活降低等問題，選擇在酶的溫度耐受性范圍內，通過提高反應溫度來保證酶的催化酸解效率，選取反應溫度55℃。

圖3 反應溫度對酶催化酸解制備MLM型結構脂質的影響

2.1.4 水分質量分數的影響

在加酶量為10 g，反應溫度為55℃，底物物質的量比為1∶4，反應時間為2 h，水分質量分數分別為 0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.50%、1%條件下，考察對酶催化酸解反應制備MLM型結構脂質含量的影響，結果見圖4。從圖4可以看出水分質量分數增加值對MLM型結構脂質的含量影響比較復雜，這是由于酶的催化反應是建立在酶特有的空間構型，水對于酶維持活性構型至關重要，但是過多的含水量一方面使底物與酶的活性位點較難結合，導致反應速率的降低，另一方面會使反應由酯化反應向水解反應轉變，導致生成目標產物的減少［10］。

圖4 水分質量分數對酶催化酸解制備MLM型結構脂質的影響

2.2 響應面分析法優化MLM型結構脂質制備條件

2.2.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，選取反應時間、底物物質的量比、反應溫度、水分質量分數為試驗因素，MLM型結構脂質含量為指標。各因素的水平編碼見表1。

運用Design－Expert 7.0.0數學軟件設計四因素三水平的中心組合試驗，分析研究影響填充床固定化酶催化制備MLM型結構脂質含量主要因素，包括29個試驗，其中24個位析因試驗點，5個中心試驗點，見表2。

表1 Central composite因素及水平編碼表

表2 Central composite試驗設計及MLM型結構脂質含量測量值

2.2.2 模型的建立及顯著性分析

根據表2的試驗數據，以MLM型結構脂質含量(R1)為響應值，利用 Design－Expert 7.0.0 數學軟件對填充床制備MLM型結構脂質進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程:

R1=42.10+1.80A+1.30B+3.88C+4.55D+0.84AB+2.21AC － 1.01AD+0.82BC+1.55BD+2.24CD －6.90A2－5.96B2－3.30C2－3.78D2

由表3可知，填充床酶催化制備MLM型結構脂質含量回歸模型極顯著(P＜0.01)。模型一次項均極顯著，顯著性順序是D(水分質量分數)＞C(反應溫度)＞A(保留時間)＞B(底物物質的量比);二次項AB，BC交互項為顯著，其余均為極顯著，表明各試驗因素對響應值的影響不是線性關系。預測方程的決定系數R2=0.992 2，模型的偏離系數為5.12%，，說明方程的擬合度和可信度較高，可以較好地代表反應參數和響應值之間的關系，可以用上述回歸方程對填充床酶催化制備MLM型結構脂質含量進行分析預測和確定最佳生產工藝條件。

表3 二次多項式回歸模型ANOVA分析

2.2.3 各影響因素的交互作用分析

2.2.3.1 反應時間與底物物質的量比的交互影響

圖5顯示了在反應溫度為55℃和水分質量分數為0.10%下，反應時間和底物物質的量比對填充床制備MLM型結構脂質含量的交互影響。在底物物質的量比不變的條件下，隨著反應時間的逐漸增加，MLM型結構脂質含量出現先增大后減小的趨勢，這是由于隨著反應時間的延長，MLM型結構脂質含量增大，達到平衡后，反應時間的增加會使結構脂質出現?；D移明顯增大，導致MLM型結構脂質含量的減少。反應時間不變的條件下，隨著底物物質的量比的增大，MLM型結構脂質含量出現先增大后減小現象。

2.2.3.2 反應時間與反應溫度的交互影響

圖6顯示了在底物物質的量比為4∶1和水分質量分數為0.10%下，反應時間和反應溫度對填充床制備MLM型結構脂質含量的交互影響。在反應時間不變的條件下，隨著反應溫度的逐漸增大，MLM型結構脂質含量出現先增大后減小，原因在于反應溫度的增大，逐漸接近酶的最適溫度使酶活逐漸達到最大，當超過最適溫度時酶活受到抑制從而使MLM型結構脂質含量出現下降。在反應溫度不變的條件下，隨著反應時間的逐漸增加，MLM型結構脂質含量出現先增大后減小的趨勢。

2.2.3.3 反應時間與水分質量分數的交互影響

圖7顯示了在底物物質的量比為4∶1和反應溫度為55℃下，反應時間和水分質量分數對填充床制備MLM型結構脂質含量的交互影響。在反應時間不變的條件下，隨著水分質量分數的逐漸增大，MLM型結構脂質含量隨之增加，達到最大后出現較小幅度的下降，原因在于水分質量分數的增加使酶活性位點充分暴露從而使催化效率增大，當水分質量分數繼續增大會使產物發生水解反應。在水分質量分數不變的條件下，隨著反應時間的逐漸增加，MLM型結構脂質含量出現先增大后減小的趨勢。

2.2.3.4 底物物質的量比與反應溫度的交互影響

圖8顯示了在反應時間2 h和水分質量分數為0.10%下，底物物質的量比和反應溫度對填充床制備MLM型結構脂質含量的交互影響。在反應溫度不變的條件下，隨著底物物質的量比的逐漸增加，MLM型結構脂質含量出現先增大后減小的趨勢，原因在于隨著底物物質的量比的增大，會使反應向著產物增加的方向進行，但當底物物質的量比達到一定程度時，反應體系的pH很低，一方面導致酶活的降低甚至喪失，另一方面也會使反應產物發生酸解。當底物物質的量比不變的條件下，隨著反應溫度的增加，MLM型結構脂質含量出現先增大后減小的趨勢，但是減少較小。

2.2.3.5 底物物質的量比與水分質量分數的交互影響

圖9顯示了在反應時間2 h和反應溫度為55℃下，底物物質的量比和水分質量分數對填充床制備MLM型結構脂質含量的交互影響。在所選的范圍內存在極值，即存在響應面最高點。沿水分含量軸向等高線較沿底物物質的量比軸向等高線密集，說明水分質量分數對MLM型結構脂質含量影響比底物物質的量比顯著。

2.2.3.6 反應溫度與水分質量分數的交互影響

圖10顯示了在反應時間2 h和底物物質的量比為4∶1時，反應溫度和水分質量分數對填充床制備MLM型結構脂質含量的交互影響。反應溫度和水分質量分數對MLM型結構脂質含量影響都較顯著，當反應溫度較低時，水分質量分數的增加對MLM型結構脂質含量影響較為明顯，出現先增大后減小的趨勢。當溫度達到一定程度時，隨著水分質量分數的增加，MLM型結構脂質含量減小的趨勢減緩。綜合圖5～圖10可知，4個試驗因素對填充床制備MLM型結構脂質含量的影響均不是簡單的線性關系，且影響都極顯著。水分質量分數是影響填充床制備MLM型結構脂質含量的最主要因素，其次是反應溫度，底物物質的量比對其影響最小。

2.2.4 制備MLM型結構脂質最佳條件的確定及驗證

通過Design－Expert 7.0.0數學軟件得出最佳制備MLM型結構脂質條件:保留時間為2.12 h，底物物質的量比為4.32，反應溫度為60.14℃，水分質量分數為0.15%?；貧w方程預測MLM型結構脂質摩爾分數為46.66%。

在實際的操作過程中，填充床固定化酶制備MLM型結構脂質工藝條件為:保留時間為2 h，底物物質的量比為4.5，反應溫度為60℃，水分質量分數為0.15%。得到 MLM型結構脂質摩爾分數為46.12%，與理論預測值基本一致，相對誤差為1.16%。說明回歸方程與實際情況擬合很好，驗證了所建立模型的正確性，該工藝參數具有實用價值。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過 Design－Expert 7.0.0數學軟件分析保留時間、底物物質的量比、反應溫度和水分質量分數等因素對制備MLM型結構脂質的影響，優化確定填充床固定化酶催化制備MLM型結構脂質的最佳工藝條件:保留時間為2 h，底物物質的量比為4.5，反應溫度為60℃，水分質量分數為0.15%。在此工藝條件下MLM型結構脂質物質的量分數為46.12%，在最佳工藝條件下重復試驗MLM型結構脂質物質的量分數為46.66%，與方程模型預測一致。

［1］喬國平，王興國.功能性油脂－結構脂質［J］.糧食與油脂，2002，9:33 －36

［2］王瑛瑤.新型功能性油脂－結構脂質的研究現狀［J］.食品研究與開發，2008，29(4):162 －164

［3］郭玉寶，裘愛泳，徐霞.酶促酯交換制備定向結構脂質研究［J］.糧食與油脂，2001(8):31－33

［4］王瑛瑤.結構脂質的研究進展［J］.糧油食品科技，2007，15(2):25－28

［5］P A Nunes，P Pires Cabral.Production of MLM － Type struc-tured lipids catalyzed by immobilized Heterologous Rhizopus oryzae lipase［J］.J Am Oil Chem Soc，2011，88(4):473－480

［6］Maya Guncheva，Diana Zhiryakova，Nadia Radchenkova.Properties of immobilized lipase from Bacillus stearothermophilus MC7.acidolysis of triolein with caprylic acid［J］.World J Microbiol Biotechnol，2009，25:727 －731

［7］安廣杰，侯冰冰，王瑛瑤，等.超高效液相色譜法測定油脂中甘三酯組成［J］.中國油脂，2011，36(5):55－58

［8］羅貴民.酶工程［M］.北京:化學工業出版社，2003:24－27

［9］H Mu，X Xu.Production of specific structured triacylglycerols by lipase catalyzed interesterification in a laboratory scale continuous reactor［J］.J Am Oil Chem Soc.，1998，75(9):1187－1193

［10］Garciahs，Acrosja，Keoughkj，et al.Immobilized lipase mediated acidolysis of butter oil with conjugated linoleic acid:batch reactor and packed bed reactor studies［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2001(11):623 －632.