‘金薄香’核桃新品種同工酶分析初報

王勇，張海濤，楊曉宇，趙士粵，溫映紅，武彥霞，劉朝紅，田鑫

（山西省農業科學院 果樹研究所，山西 太谷030815）

‘金薄香’核桃是山西省農科院果樹研究所以新疆優質薄皮核桃為母本采用實生選種法經過20多年選育而成的1～8號系列早實薄殼優良新品種。近年來研究［1，2］表明，植物的表型特性遺傳是數量性狀遺傳，有分離現象，是由多基因控制的性狀。植物的一些優良表型性狀，通過同工酶分析，可作為品種鑒定、苗木繁殖、遺傳多態性分析的依據。為深入了解‘金薄香’核桃新品種的遺傳特性，本試驗以‘金薄香’8個核桃新品種為試材，對其品種間同工酶酶譜的差異進行研究，以期探究核桃性狀的遺傳規律。利用同工酶作為遺傳信息表達的指標，從遺傳角度探討各品種分類性狀的價值及品種間的親緣關系，并為尋找早實核桃基因表達及分子標記等一系列研究提供基礎［3～5］。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所選用材料為山西省農科院果樹所試驗園的‘金薄香’核桃母株。采樣時期及部位：于2010年7月15日取自上而下第三功能葉片。

1.2 方法

試材葉片，采后立即放于編號的密封袋內，投入冰盒內并帶回實驗室。用蒸餾水將葉片沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分并用電子天平稱取1.0g，剪碎后放入研缽進行液氮研磨，轉入10mL離心管內，再加入6mL樣品提取液，低溫靜置后置于高速冷凍離心機，溫度調至0～4℃，轉速12 000 r·min－1，離心20min，取上清液電泳。

采用不連續垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，依次在樣品槽內加樣后在電泳槽內緩慢加入電極緩沖液，滴加溴酚藍指示劑，接通電源開始電泳，預電壓為穩壓120V，當溴酚藍指示劑進入分離膠后將電壓調至穩壓240V，電泳槽置于4℃冰箱內進行電泳。當溴酚藍指示劑距分離膠底面1～2cm時結束電泳后，進行POD，SOD，AMY，PPO四種同工酶的染色。

過氧化物酶POD染色［6］：取醋酸聯苯胺溶液（2g聯苯胺溶于18mL冰醋酸，加水72mL）1 mL，3%過氧化氫0.4mL，加水至20mL（臨用現配），將膠板置于上述染色液中，在37℃下保溫10min。

淀粉酶AMY染色［6］（負染）：膠板在1%淀粉溶液（用0.04mol·L－1pH 7.0 的磷酸緩沖液配制）中于25℃保溫30min，用0.04mol·L－1pH 7.0磷酸緩沖液洗滌10min ，再浸入0.005 mol·L－1I2－KI試劑中，輕微振蕩數分鐘。

以上染色后的膠板用雙蒸水沖洗，置于5%醋酸中保存，拍照或描模式圖譜。

超氧化物歧化酶（SOD）染色方法：將膠板沖洗1～2次，置于含0.25mol·L－1NBT的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸鹽緩沖液內黑暗振蕩染色20 min，棄去染液；再將膠板置于含0.01%核黃素的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸鹽緩沖液內黑暗振蕩染色20min，棄去染液；最后將其置于含0.1mmol·L－1EDTA的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸鹽緩沖液中，在距膠板10cm處40W日光燈光照15～20min即可看到淺紫色背景下的白色條帶。蒸餾水漂洗1～2次后拍照記錄。

多酚氧化酶（PPO）酶染色方法：將膠板置于50mL 0.01%對苯二胺，150mL 1%鄰苯二酚，50 mL 0.05mol·L－1，pH 6.8磷酸鹽緩沖液的混合染色液中，于30℃恒溫振蕩染色30min，棄掉染色液，加入脫色液振蕩脫色至紅褐色條帶清晰為止。

相對遷移率Rf的計算公式如下：

酶帶遷移率 ＝ 酶帶遷移距離／溴酚藍指示劑遷移距離。

2 結果與分析

2.1 淀粉酶AMY同工酶酶帶分析

如圖1所示，自右到左分別為‘金薄香’1號到8號。如圖譜所示，統計每個品種各自的酶帶數，8個品種都有3條基本的共有譜帶，其表達量較高。6號、7號除基本共有譜帶外，還有一條特異性酶帶。除6號外，其他7個品種還有一條基本的共有酶帶，表達量較弱。根據淀粉酶酶帶A2可區別6號、7號與其他品種。采用AMY同工酶分析法可以對‘金薄香’品種間進行輔助鑒定。

圖1 AMY同工酶酶帶分析圖Fig.1 Amylase isoenzymes bands of Jinboxiang Series Walnut

2.2 多酚氧化酶PPO同工酶酶帶分析

如圖2所示，自右到左分別為金薄香1號到8號。由圖2可看出，PPO酶帶較少，統計每個品種各自的酶帶數 ，計算其各自酶帶的相對遷移率，8個品種都有3條基本的共有譜帶，遷移率分別為0.47，0.50和0.53，表達量較高，并無特異性差異酶帶。1號、3號、4號多酚氧化酶表達量最高，2號、7號表達量中等，5號、6號表達量最低。根據多酚氧化酶酶帶不能鑒別金薄香系列核桃品種。采用PPO同工酶分析法不能對‘金薄香’品種間進行輔助鑒定，不作為較為方便和有效的手段。

圖2 PPO同工酶酶帶分析圖Fig.2 Polyphenol oxidase isoenzymes bands of Jinboxiang Series Walnut

2.3 超氧化物歧化酶SOD同工酶酶帶分析

如圖3所示，自右到左分別為金薄香1號到8號。根據酶譜電泳分離特性劃分區帶，按照從陰極到陽極的順序，可將“金薄香”系列核桃的SOD同工酶譜帶大致分為2個區，分別是SODA區和SODB區。按照從陰極到陽極的方向依照所屬區間再用數字編號，統計每個品種各自的酶帶數，計算出各自酶帶的相對遷移率，由圖3可看出，2號、4號、5號、7號和8號第一區（SODA區）的共同酶帶位置有3個，電泳遷移率分別指示為0.19，0.24和0.27。3號、6號品種都無此酶帶。第二區（SODB區）中8個品種都有8條基本的共有譜帶，其遷 移 率分別為 0.46，0.48，0.51，0.54，0.58，0.62，0.66，0.79。從電泳圖譜和酶帶數統計來看，2號、5號、7號和8號的電泳圖譜完全相同外，其他每一個品種的SOD同工酶圖譜都具有特異性，相互之間區別明顯。1號有一條特異性酶帶S4，遷移率為0.42。3號、4號、7號缺少遷移率為0.42的酶帶S5。因此，采用SOD同工酶分析法可以對‘金薄香’品種間進行輔助鑒定。

圖3 SOD同工酶酶帶分析圖Fig.3 Superoxide dismutase isoenzymes bands of＇Jinboxiang＇Series Walnut

2.4 過氧化物POD同工酶酶帶分析

如圖4所示，自右到左分別為金薄香1號到8號。過氧化物酶酶帶較少，統計每個品種各自的酶帶數，計算出各自酶帶的相對遷移率，8個品種都有4條基本的共有譜帶P1，P2，P3，P4，遷移率分別為0.36，0.37，0.41，0.44。Rf＝0.47酶譜帶P5為8號的特有帶，Rf＝0.55，Rf＝0.59兩條酶帶P6和P7是1號、3號、4號的共有酶帶。根據過氧化物酶特異性酶帶P5可鑒定8號，酶帶P6和P7可區別1號、2號、3號、4號與其他品種。采用POD同工酶分析法對‘金薄香’品種間進行輔助鑒定是一種較為方便和有效的手段。

圖4 POD同工酶酶帶分析圖Fig.4 Peroxidase isoenzymes bands of＇Jinboxiang＇Series Walnut

3 小結與討論

同工酶是一種特異蛋白質，是基因（DNA片段）表達的直接產物，不同基因組成會在同工酶譜上表現出來，即同工酶是基因分子水平的表現型，是基因和外在性狀的連接物，基因的微小變化會引起同工酶的變化。因此，可從同工酶譜的變化及酶譜特征了解品種間的親緣關系和品種間的差別。植物在進化過程中，形成了不同親緣關系的物種，一定的親緣關系反映了植物在基因型上存在某種相關性，分類學中一般依據物種所表現的性狀來判斷這種聯系。同工酶是基因表達的產物，可以從同工酶酶譜的分析來識別基因的存在和表達，種與種或品種之間，酶譜的共同特征越多，說明親緣關系越近。

聚丙烯酰胺凝膠電泳的垂直板型電泳法是近年來用途較廣的一種相對含量的測定方法。它的優點是在同一條件下可以電泳多個樣品，便于相互比較；另外還可以制成干板便于掃描、攜帶和保存。

采用AMY、SOD、POD同工酶3種分析法，‘金薄香’核桃品種間同工酶帶差異較明顯，可以作為對‘金薄香’品種進行輔助鑒定的有效方法。而采用PPO同工酶分析法，同工酶帶差異不顯著，不能作為對此品種進行輔助鑒定的方法。

［1］Praka S R C Lewotlin.J L Hubby.A Molecular approach tot the study of genetic heterozygosity in natural population，patterns of genetic variation in cetrol，marginal and isolated populations of drosophila pseudoobscura［J］.Genetics，1969，61：841－858.

［2］張以忠，陳慶富.同工酶在植物系統學研究中的作用［J］.貴州師范大學學報：自然科學版，2005，23（2）：107－112.

［3］胡能書，萬賢國.同工酶技術及其應用［M］.長沙：湖南科學技術出版社，1985：104－112.

［4］王金勝.農業生物化學技術［M］.太原：山西科學技術出版社，1997：64－80.

［5］毛盛賢，向華.同工酶遺傳學引論［M］.北京：首都師范大學出版社，2000.

［6］何忠效，張樹政.電泳［M］.北京：科學出版社，1999：258－308.