純化紅茶多糖抑制白血病細胞增殖的實驗研究

彭利劍，趙曉盼，王海杰，趙文秀 (.德惠市人民醫院檢驗科，吉林 德惠 30300;.吉林醫藥學院008級藥學本科，吉林吉林 303;3.吉林醫藥學院化學教研室，吉林吉林 303)

中國是茶文化的發源地，傳統中醫、現代醫學都重視茶的藥用研究［1］。糖多糖除具有降血脂、防治血栓和增強免疫等功效外，近年來還發現粗制多糖對多種腫瘤有抑制作用［2］。我國的產茶區分布廣，茶葉品種多，但對茶的成分和功效影響最大的卻是茶葉發酵的程度。綠茶為非發酵茶，紅茶為充分發酵茶，而烏龍茶屬于半發酵茶。茶的鮮葉經發酵后所含的多酚被氧化、葉綠素被分解，因此變為紅色、褐色或黑色;此過程中糖的含量和結構也發生改變［3］。目前認為，紅茶的糖類含量相對高，組成與結構穩定，從中提取多糖抗腫瘤的研究受到重視。本研究以中國福建的“正山小種”紅茶為原料，采用水浸泡的方式提取茶多糖，用大孔樹脂層析法制備純化的紅茶多糖(black tea polysaccharides，bTPS)，并采用酪胺還原法標記異硫氰酸熒光素(fluorescinisothiocyate，FITC)，以bTPS和FITC-bTPS為材料，研究純化紅茶多糖對白血病細胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人白血病細胞K562和U937凍存于液氮中;自制bTPS和FITC-bTPS避光保存于-20℃;1640培養液購自Hyclone公司;小牛血清購自浙江黃巖四季青公司;CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養

復蘇K562細胞和U937細胞，在含10%血清的1640培養液、37℃和5%CO2條件下培養，每周傳代3次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞增殖檢測

將細胞濃度調整為104/mL，按每孔100 μL接種96孔板，用1640培養稀釋 bTPS，分別加入到96孔板，使終濃度分別為 0、25、50、75 和 100 μg/mL。繼續培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，空白對照組加入10 μL的PBS。37℃孵育2 h后，用多功能酶標儀檢測各孔在450 nm的吸光度值(A450)。按照下列公式計算細胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)

1.4 輻射條件及測量工具

取對數生長期細胞，調密度為5×106/mL。取100 μL細胞懸液，加FITC-bTPS使其終濃度分別為0、25、50 和 100 μg/mL，室溫下避光反應 1 h 后 PBS洗2次，將細胞懸于250 μL PBS，加入等體積的4%多聚甲醛，細胞被固定于2%的多聚甲醛。相同方法加入50 μg/mL的FITC-bTPS，與細胞共同孵育時間分別0、30、60和120 min，洗滌后固定細胞。細胞樣品避光存放于4℃冰箱，24 h內完成流式細胞術分析。先以無FITC-bTPS處理的細胞為陰性對照組，收集細胞在FL1(525 nm)通道內的熒光信號;調節電壓和增益，使細胞群位于陰性區域內，設置陰性門“N”和陽性門“P”。來檢測各實驗組細胞，以陽性細胞的百分率和陽性細胞群平均熒光強度(mean)來顯示FITC-bTPS與細胞間的結合。

1.5 統計學分析

以3次獨立實驗的平均值代表最終結果，均數間的比較采用t檢驗，顯著性標準α=0.05。

2 結果

2.1 bTPS抑制白血病細胞增殖

隨濃度增加(0、25、50、75 和 100 μg/mL)，U937和K562細胞的增殖受到顯著抑制，相同濃度下bTPS對U937細胞抑制作用強于K562細胞 (P＜0.05)(圖1)。

圖1 bTPS抑制U937和K562細胞增殖

2.2 FITC-bTPS與白血病細胞結合

50 μg/mL的 FITC-bTPS 反應1 h，U937 和 K562細胞中陽性百分率接近;但前者熒光強度值高(P＜0.05)(圖2)。通過分析發現，U937細胞陽性率隨FITC-bTPS濃度增加而增加(表1);但反應時間對陽性率影響較小(表2)。

圖2 FITC-bTPS與U937和K562細胞結合

表1 濃度對FITC-bTPS結合白血病細胞的影響(S)

表1 濃度對FITC-bTPS結合白血病細胞的影響(S)

*對照組比較，P＜0.05

組 別g/mL 21.3±3.4 18.4±3.7 50 μg/mL 44.8 ±4.5* 43.2 ±5.1*100 μg/mL 67.5 ±6.3* 64.2 ±5.2 U937 K562 25 μ*

表2 孵育時間對FITC-bTPS結合白血病細胞的影響(S)

表2 孵育時間對FITC-bTPS結合白血病細胞的影響(S)

*對照組比較，P＜0.05

組 別U937 K562 30 min 41.3±4.2 39.5±3.9 60 min 44.8±4.5 51.6±5.7*120 min 43.2±5.1 47.5±4.8*

3 討論

多糖(polysaccharides)是由單糖之間脫水而形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線性或分枝連接而成的聚合物。多糖廣泛存在于動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中，參與細胞的各種生命現象的調節［3］。人們對動物來源的殼聚糖，植物來源的靈芝多糖和細菌來源的脂多糖、甘露糖等多糖的研究較多，上述多糖均具有一定的免疫調節以及抗腫瘤活性。甘露聚糖與細胞膜上甘露糖受體結合，而殼聚糖和脂多糖與Toll樣受體家族(Toll like receptors，TLRs)中的 TLR-2、TLR-4和TLR-7結合［4］。單核巨噬細胞TLR-4等結合配體后，細胞內的p-38 MAPK信號通路被激活，啟動IL-2、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 等細胞因子基因轉錄，增強單核巨噬細胞吞噬、殺傷功能;而活化巨噬細胞可通過釋放細胞因子等方式促進T細胞的活化。雖然大量實驗表明多糖可通過調節免疫功能抗腫瘤，但近年來多糖分子抑制腫瘤細胞增殖或誘導其凋亡的證據也陸續被報道。例如，靈芝多糖直接誘導體外培養的白血病細胞THP-1和HL-60細胞發生凋亡;殼聚糖抑制乳腺癌細胞 MCF-7增殖并誘導其凋亡［5-6］。以往對茶葉抗腫瘤成分的研究主要集中于多酚化合物，因此茶多糖對腫瘤細胞的直接作用了解較少。本研究發現，純化的bTPS可以濃度依賴的方式直接抑制兩種白血病細胞的增殖。FITC-bTPS結合細胞后，流式細胞術分析其以濃度依賴的方式與細胞結合。相同濃度的FITC-bTPS處理后，U937細胞的平均熒光強度高于K562細胞，而bTPS對U937的抑制效應也強于K562細胞。這些結果表明，bTPS可直接結合腫瘤細胞而抑制其增殖。

利用純化的bTPS和FITC-bTPS，不僅可以測定茶多糖對腫瘤細胞增殖、凋亡的影響，也可利用熒光素的示蹤作用，深入探討其抗腫瘤的機制。bTPS是否也與細胞表面的TLRs結合而發揮作用，將在今后的實驗中繼續探討。

［1］謝明勇，聶少平.茶葉多糖的研究進展［J］.食品與生物技術學報，2006，25(2):107-114.

［2］崔宏春，江和源，張建勇，等.茶多糖的結構研究進展［J］.安徽農業科學，2009，37(1):200-203.

［3］沈 健，陳增良，沈香娣，等.茶多糖抗腫瘤及其增強免疫作用的研究［J］.浙江預防醫學，2007，19(8):10-12.

［4］毛 華，楚慧麗，劉月冉，等.免疫細胞多糖受體及其研究方法［J］.食品與藥品，2011，13(3):136-138.

［5］Jiang M，Ouyang H，Ruan P，et al.Chitosan derivatives inhibit cell proliferation and induce apoptosis in breast cancer cells［J］.Anticancer Res，2011，31(4):1321-1328.

［6］Wang J H，Zhou Y J，Zhang M，et al.Active lipids of Ganoderma lucidum spores-induced apoptosis in human leukemia THP-1 cells via MAPK and PI3K pathways［J］.J Ethnopharmacol，2012，139(2):582-589.