海帶中巖藻聚糖硫酸酯提取工藝評價模型的建立與探討

曲桂燕, 劉 旭, 汪東風, 袁 毅, 韓麗君

(1. 中國海洋大學 食品科學與工程學院, 山東 青島266003; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島266071;3. 安徽農業大學 茶與食品科技學院, 安徽 合肥 230036)

巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan), 又名巖藻多糖或褐藻糖膠, 是一種水溶性的硫酸雜多糖, 普遍存在于褐藻和一些棘皮動物中。研究發現巖藻聚糖硫酸酯具有抗凝血[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3-4]、抗病毒[5-7]等多種生物學活性, 并且隨著其應用價值的不斷提升,需求量也在增加。因此如何提高巖藻聚糖硫酸酯中主要成分的提取率是對其進行產業化利用的關鍵。

巖藻聚糖硫酸酯的主要成分除了L-巖藻糖和硫酸根外, 還含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質等, 越來越多的研究表明, 其活性與硫酸根含量和位置[2,5]密切相關。不同的提取方法、提取工藝條件對巖藻聚糖硫酸酯得率有很大影響, 而且對其多糖含量與硫酸根含量的影響不同。雖然劉紅英等[8]和李兆新等[9]對巖藻聚糖硫酸酯的含量測定進行了一些探討, 但由于其組成復雜還沒有標準方法。因此在提取純化過程中, 評價指標也各不相同,大部分用粗多糖質量[10-18]、粗多糖中多糖含量[19-22]來表示。其他的評價方法有: 根據劉紅英的方法測定巖藻多糖的含量[23-24]; 根據多糖和硫酸根的總質量分數[25]來評價; 對多個單獨指標[23-24,26-31]進行綜合考慮。為了得到合理的優化結果, 需要恰當的評價指標, 但很少有人關心評價指標對因素選擇的影響。

由于巖藻多糖主要由巖藻糖和硫酸根組成, 這兩者的成分含量對巖藻多糖的活性起很重要的作用,本文以粗多糖提取率(%)、巖藻糖提取率(%)和硫酸根提取率(%)的加權評分為指標通過均勻設計試驗來優化提取工藝并系統分析各實驗因素對不同指標的影響, 從而有目的地指導生產。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 試驗材料與試劑

海帶由山東日照潔晶集團提供, 于2011年8月在山東榮成采集。將海帶洗凈、40℃烘干、磨碎、過100目篩后, 貯存于密閉玻璃瓶中備用。

95%乙醇; K2SO4、BaCl2、明膠、濃鹽酸;L-半胱氨酸鹽酸鹽、濃硫酸以上試劑均為國產分析純。標準品:L-巖藻糖(Fuc)(Sigma)。

1.1.2 儀器

ADVENTURERTM系列電子天平, 奧豪斯儀器(上海)有限公司; DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器, 鄭州長城科工貿有限公司; SC-3610低速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司; RE-2000旋轉蒸發器, 上海亞榮生化儀器廠; LGJ-12冷凍干燥機, 北京松源華興科技發展有限公司; UV-2000型分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司; 數顯恒溫水浴鍋 HH-4國華電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝流程

干海帶經熱水浸提后, 再經離心、濃縮、醇析、冷凍干燥, 得到巖藻聚糖硫酸酯粗品, 稱重后計算得率, 并測定巖藻糖和硫酸根含量。其工藝流程如圖1所示。

圖1 海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝流程圖Fig. 1 The flow chart of hot water extracting process of fucoidan from Laminaria japonica

Yw: 粗多糖提取率(%)=粗多糖的質量/藻粉的質量×100%

Yf: 巖藻糖提取率(%)=(粗多糖的質量×巖藻糖的百分含量)/藻粉的質量×100%

Ys: 硫酸根提取率(%)=(粗多糖的質量×硫酸根的百分含量)/藻粉的質量×100%

1.2.2 測定方法

巖藻糖含量測定[32]: 采用 Gibbons比色法測定多糖中L-巖藻糖含量。得回歸方程:y=0.0009x-0.0015,R2=0.9934。

硫酸根含量測定[33]: 采用 Dodgson比濁法測定多糖中硫酸根含量。得回歸方程:y=2.6999x+0.0062;R2=0.9969。

1.2.3 提取試驗設計

在前期預實驗和參考文獻[11,13,15,17,21,25]的基礎上, 選擇影響提取效果的 3個主要因素: 浸提溫度(X1)、浸提時間(X2)、液料比(X3)進行考察, 并以粗多糖提取率(Yw)、巖藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)為評價指標。

各因素分別選擇6個水平, 因素水平見表1。根據表1 的因素及水平, 選用均勻設計表U12* (123),并通過擬水平法適當改造, 依據規定[34-35]使用, 其均勻性D=0.183 8。

1.2.4 數據處理

采用 Minitab軟件對實驗數據進行逐步回歸分析, 篩選顯著變量, 建立回歸方程, 并通過回歸方程進行規劃求解, 從而得到優化的海帶巖藻多糖提取條件。

2 結果與討論

2.1 試驗方案及分析結果

表1 因素水平表Tab. 1 The factor-level list for uniform design

采用水提法從海帶中提取巖藻聚糖硫酸酯, 以粗多糖提取率(Yw)、巖藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)為評價指標指標, 并采用綜合加權評分法綜合考慮各試驗因素對以上三個指標的影響。綜合加權評分法是在多指標的優化試驗中, 根據每個指標優選的條件可能會相互矛盾, 對某一指標的有利的條件可能對其他指標不利, 因此試驗中引入一個綜合指標, 來考察指標的綜合效果。根據各指標的重要性,將粗多糖提取率( %)、巖藻糖提取率(%)、硫酸根提取率(%)的權重系數分別設定為0. 1, 0. 45,0. 45。為在統一標準下加權評分, 分別將最好的試驗結果定為100, 其他試驗結果采用適宜的公式酌情記分。根據選定的均勻設計表, 在各組條件下進行實驗, 結果見表2。

2.2 各實驗因素對單個評價指標 Yw、Yf和Ys的影響

2.2.1 優化數學模型的建立

利用Minitab 16統計軟件分別對粗多糖提取率(Yw)、巖藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)進行回歸分析, 采用二次型回歸模型, 自變量X1,X2,X3采用中心化處理[35], 并采用逐步回歸的方法篩選變量,得到回歸方程及其顯著性檢驗如表3所示。

表2 熱水提取巖藻聚糖硫酸酯均勻設計試驗方案及分析結果Tab. 2 Conditions and analysis results of hot water extracting process of fucoidan from Laminaria japonica by uniform design

表3 Yw、Yf和Ys的回歸方程及其顯著性檢驗Tab. 3 Results and significance tests of quadratic polynomial stepwise regression of significance tests of Yw、Yf and Ys

在上述模型中P值都小于 0.05, 說明回歸方程在α=0.05水平上顯著, 模型方程具有統計學意義,整體擬合效果不錯。但模型Yw的顯著性P=0.029比模型Yf和Ys要小, 同時模型Yw的復相關系數r=0.811, 決定系數R2=0.658, 說明模型方程預測精度較低。由于本實驗沒有進一步純化, 存在褐藻膠的干擾, 所以單純以沉淀物干重計算得率會有很大偏差。而以巖藻糖和硫酸根含量計算提取率得到的回歸模型擬合較好, 說明評價指標對優化工藝上有很大影響。

2.2.2 因素效應分析

通過t檢驗得到各相關系數的顯著性檢驗結果如表 4所示。從表中可以看出各實驗因素對評價指標的影響大小。

從表4中可以看出各試驗因素對Yw的影響大小為X1>X3>X1X2, 其中X1提取溫度對粗多糖得率影響最顯著, 其次是X3液料比, 而X2提取時間影響效果不顯著, 且與溫度的交互作用對其有負面影響; 對Yf的影響大小為X12>X2X3>X1, 其中X12提取溫度的二次項對巖藻糖提取率的影響最顯著, 其次是X2X3的交互作用, 而X2、X3單獨影響效果不顯著; 對Ys的影響大小為X1>X32>X1X2>X22>X3, 其中X1提取溫度對硫酸根得率的影響最顯著, 其次是X3液料比的二次項, 而X2提取時間影響效果不顯著。

表4 Yw、Yf和Ys偏回歸系數的顯著性檢驗Tab. 4 Significance tests of regression coefficients obtained by the quadratic polynomial regression models of Yw, Yf and Ys

經上述分析發現, 提取溫度(X1)對粗多糖提取率(%)、巖藻糖提取率(%)、硫酸根提取率(%)影響都最顯著, 液料比(X3)對粗多糖提取率(%)和硫酸根提取率(%)的影響都較顯著, 而提取時間(X2)影響效果不顯著, 且其交互作用都存在負面影響。因此各實驗因素對巖藻糖含量與硫酸根含量的影響不同, 需綜合考慮。

2.3 各實驗因素對加權評分的影響

2.3.1 優化數學模型的建立

按2.2.1對加權值Y進行回歸分析, 得到回歸方程:Y= 65.2 + 0.555x1+ 1.73x2+ 0.587x3+ 0.0236x12+0.0939x32-0.110x1x2;其 中x1=X1-75.0,x2=X2-3.5,x3=X3-22.5。

模型的復相關系數R=0.944;F=6.85,p=0.026<0.05, 說明回歸方程在α=0.05水平上顯著,模型方程具有統計學意義, 整體擬合效果不錯。模型的決定系數R2=0.892, 調整決定系數R2=0.762, 說明模型方程具有較高的預測精度。并且通過加權值Y得到的回歸方程與通過Yw、Yf和Ys得到的回歸方程相比其預測精度有了很大的提高, 因此, 該模型預測熱水浸提巖藻多糖的工藝參數是可行的。

2.3.2 因素效應分析

通過 t檢驗得到各相關系數的顯著性檢驗結果如表5所示。從表5中可以看出對加權值Y的影響大小為X1>X32>X12>X3>X1X2>X2, 其中X1提取溫度對總提取率的影響最顯著, 其次是X3液料比的二次項, 而X2提取時間的單獨影響效果不顯著。

表5 加權值Y偏回歸系數的顯著性檢驗Tab. 5 Significance tests of regression coefficients obtained by the quadratic polynomial regression model of Y

2.4 工藝條件參數優化

根據加權評分Y得到的回歸方程進行規劃求解,并結合上述分析, 得到巖藻聚糖硫酸酯最佳提取條件為x1=25,x2=-2.5, x3=12.5(X1=100,X2=1,X3=35),即提取溫度100℃, 提取時間1h, 液料比35(mL:g)。

2.5 驗證試驗

按優化后的條件進行優化工藝驗證試驗, 巖藻聚糖硫酸酯粗多糖得率可達 6.50%, 其中巖藻糖提取率為2.65%, 硫酸根提取率為1.36%。驗證試驗加權評分Y實測值為112.01, 比均勻實驗中的12 組實驗結果都高, 與回歸模型的預測值 118.38相對誤差為0.0539。由此表明試驗中所設模型是合適的, 能夠為海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝提供理論指導。

3 結論

采用均勻設計法優化海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝, 首次將粗多糖提取率(Yw)、巖藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)同時作為評價指標, 綜合考慮各試驗因素對以上三個指標的影響。結果表明:

(1)通過加權值Y得到的回歸方程與通過Yw、Yf和Ys得到的回歸方程相比具有較高精度和顯著性。

(2)利用加權值Y得到的回歸模型進行規劃求解,得到優化提取工藝參數為提取溫度100℃, 提取時間1 h, 液料比35(mL:g)。

(3)利用回歸模型對實驗結果進行預測, 其相對誤差為5.39%。并且巖藻聚糖硫酸酯粗多糖得率可達6.50%, 其中巖藻糖提取率為 2.65%, 硫酸根提取率為1.36%。

因此, 本文探討和建立的海帶中巖藻聚糖硫酸酯提取工藝評價模型, 通過加權評分作為評價指標可綜合考慮海帶巖藻聚糖硫酸酯的產量和其主要成分含量, 對巖藻聚糖硫酸酯的工業提取提供了理論參考。

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