超聲波協同纖維素酶對黃精多糖和皂苷的提取研究

陶 濤，李立祥，張 芳，李 惠

（安徽農業大學茶葉生物化學與生物技術教育部、農業部重點實驗室，安徽合肥 230036)

超聲波協同纖維素酶對黃精多糖和皂苷的提取研究

陶 濤，李立祥*，張 芳，李 惠

（安徽農業大學茶葉生物化學與生物技術教育部、農業部重點實驗室，安徽合肥 230036)

以九華山黃精為原料，水為提取溶劑，采用超聲波協同纖維素酶方法對其多糖和皂苷進行綜合提取。通過單因素和正交實驗研究了纖維素酶與底物質量比、超聲時間、超聲溫度、浸提pH、超聲功率對多糖和皂苷提取率的影響。結果表明：影響最顯著的是纖維素酶與底物質量比，其次是浸提pH以及超聲功率，超聲時間和超聲溫度的影響相對較小。優化得出最佳提取工藝是纖維素酶與底物質量比1%，超聲時間40min，超聲溫度55℃，浸提pH5.0，超聲功率300W。此時的多糖和皂苷提取率分別是39.36%和11.69%。相比傳統提取方法，大大提高了多糖和皂苷的提取率。

黃精，超聲波，纖維素酶，多糖，皂苷

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精 九華山，安徽天品堂生態農業有限公司提供的地藏黃精，屬多花黃精（Polygonatum cy-rtonema Hua），三年生；人參皂苷對照品Rb1 中國藥品檢驗所；纖維素酶 張家港金源生物化工有限公司，50000u/g；試劑 均為分析純；水 去離子水。

UV-2102C型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；YBY-400中藥粉碎機

嘉騰機電有限公司；HH-6型電熱恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AB104-N型電子天平 Metter-Toledo Group；SENCOR系列旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司；PB-10酸度計 Metter-Toledo Group；DL-5-B低速離心機 CNETRIFUGE。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精的預處理 在對黃精成分測定的基礎上，結合黃精多糖、皂苷含量以及經濟價格的綜合考慮，選取三年生黃精，烘干，粉碎，過40目篩，備用，測其干物質量91.68%。

1.2.2 黃精多糖和皂苷的粗提取方法 準確稱取2.0000g黃精粉末，以水為提取溶劑按1∶15的比例加入提取試管中，用0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液將溶液調至一定pH。稱取一定量的纖維素酶，加入10倍的0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液在40℃活化30min。將酶液加入提取試管中，在一定超聲功率、溫度等條件下提取一定時間，在95℃下滅酶20min。趁熱過濾，將濾液用旋轉蒸發儀（60℃）濃縮、冷卻、定容至25mL，取2.5mL濃縮液定容至25mL，得皂苷待測液。取2mL濃縮液加入一定倍數體積的無水乙醇，攪拌均勻后置4℃冰箱中靜置過夜，低速離心（4200r/min，10min），得多糖沉淀，熱水溶解定容至500mL得多糖待測液。

1.2.3 多糖和皂苷測定方法 多糖測定方法[12]：蒽酮比色法。制得的標準曲線為：y=7.0688x+0.0251（x為多糖濃度，y為吸光度，R2=0.9958）。

多糖提取率（%）=（10-3C1×V1/m）×100%

式中：C1為由回歸方程計算得出的多糖的濃度（mg/mL）；V1為多糖稀釋后體積（mL）；m為黃精干物質的量（g）。

皂苷測定方法[13]：香草醛-冰醋酸-硫酸法。制得的標準曲線為：y=0.0046x-0.0444（x為皂苷濃度，y為吸光度，R2=0.9996）。

皂苷提取率（%）=（10-6C2×V2/m）×100%

式中：C2為由回歸方程計算得出的皂苷的濃度（μg/mL）；V2為皂苷稀釋后體積（mL）；m為黃精干物質的量（g）。

1.2.4 單因素實驗 在保持其他因素不變的條件下，以黃精多糖和皂苷的提取率為指標，進行單因素實驗，分別研究了纖維素酶與底物質量比、超聲時間、超聲波溫度、浸提pH、超聲功率對提取多糖和皂苷的影響。

在做單因素實驗時，用4倍無水乙醇沉淀多糖，在單因素之后用同一條件（隔夜，4℃冰箱中）加入不同倍數的乙醇濃度，考察不同倍數乙醇對沉淀多糖含量的影響。

酶與底物質量比采用的水平為：0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%；超聲時間采用的水平為：20、40、60、80、100min；超聲溫度采用的水平為：30、40、50、60、70℃；浸提pH采用的水平為：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；超聲功率采用的水平為：100、200、300、400、500W；乙醇倍數的水平為：4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5倍。

1.2.5 正交實驗 在單因素實驗的基礎上，將酶與底物質量比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、浸提pH（D）和超聲功率（E）作為考察因素，每個因素選擇4個水平（如表1），按L16（45）進行正交設計，以多糖和皂苷的提取率為指標，進行實驗。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors of orthogonal design

1.2.6 統計分析 采用DPS7.55對正交結果進行統計分析，確定最佳提取工藝條件。

1.2.7 方法對比 待正交實驗結束得出最佳提取條件后，選取相同黃精原材料，采用相同測定方法，用得出的最佳條件分別采用超聲波不加酶法、加酶不超聲水浴法和不超聲不加酶法實驗。并對實驗結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 纖維素酶與底物質量比對提取率的影響 從圖1可以看出，隨著纖維素酶與底物質量比的增加，多糖的提取率增加比較明顯，在質量比1%時多糖提取率達最大，在質量比1%之后，多糖提取率有稍微下降；皂苷的提取率在0.4%時達最大，再增加酶量皂苷提取率下降較明顯，說明酶量的增加對皂苷提取率有抑制作用。因皂苷的提取率變化量不是很大，所以以纖維素酶與底物質量比1%作為適宜濃度。

圖1 纖維素酶與底物質量比對提取率的影響Fig.1 Effect of quality ratio of cellulase enzyme to substrate on extraction rate

2.1.2 超聲時間對提取率的影響 由圖2可知，提取時間過短，可能提取不充分，但隨著時間增加，多糖和皂苷都有一定的降解。皂苷和多糖的提取率隨著超聲時間的增加而增加，并分別在40min和60min時達到最大，而且在60min時，皂苷的提取率降低不是太多，所以綜合考慮，選取60min作為適宜超聲時間。

圖2 超聲時間對提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction rate

2.1.3 超聲溫度對提取率的影響 由圖3可以看出，在50℃時皂苷和多糖的提取率都達到最大，升高溫度，提取率都有所降低。這是因為溫度會影響纖維素酶的活性，溫度低，酶活性不高，溫度過高，酶活性失活，影響提取率。所以選擇50℃作為適宜超聲溫度。

圖3 超聲溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate

2.1.4 浸提pH對提取率的影響 圖4可以看出，pH在3.0～5.0之間時，皂苷和多糖的提取率都呈上升趨勢，并且在5.0時，皂苷和多糖的提取率同時達到最大，pH增加，提取率降低。說明適宜的pH有利于酶和底物的結合，增強纖維素酶的活性，提高提取率，所以選擇5.0作為適宜pH。

圖4 浸提pH對提取率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction rate

2.1.5 超聲功率對提取率的影響 由圖5可以看出，皂苷和多糖的提取率隨著超聲功率的增大都有所提高，并分別在300W和400W時提取率達到最大，再增大超聲功率，提取率下降。這是因為當超聲波功率在一定強度范圍內可促進酶介導的反應，但強度過大酶結構會發生不可逆變化[14]。同時功率過大，會使部分皂苷和多糖發生一定降解。所以最佳提取功率應為300～400W。

圖5 超聲功率對提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic intensity on extraction rate

2.2 不同乙醇倍數對沉淀多糖的影響

由圖6可以看出，增加乙醇相對于黃精濃縮液的倍數，有利于沉淀更多的多糖，在加入7倍乙醇時沉淀基本達到最大，再增加乙醇倍數，多糖沉淀不再增加。所以選擇7倍乙醇作為最佳沉淀多糖的乙醇倍數。

圖6 乙醇倍數對沉淀多糖的影響Fig.6 Effect of multiple of ethanol on polysaccharide precipitation

2.3 正交實驗

根據單因素實驗結果得知各因素對提取結果的影響，確定正交實驗水平。酶與底物質量比對多糖和皂苷最佳提取率影響不一致，在質量比1%時多糖提取率最佳，相對于多糖提取率變化，皂苷的提取率變化幅度不大，為獲得最佳綜合提取效果，以多糖的提取結果為主要指標，所以選擇0.6%、0.8%、1.0%、1.2%四個水平。超聲時間在40min至60min內，多糖和皂苷的提取率都處在較高的水平，所以選擇30、40、50、60min四個水平。超聲溫度和浸提pH對多糖和皂苷提取影響趨勢一致，分別選擇45、50、55、60℃四個水平和pH4.5、5.0、5.5、6.0四個水平。超聲功率在300W和400W時，皂苷和多糖的提取率分別達到最大，選擇300、350、400、450W四個水平。表2為正交實驗結果。

根據表2可知，多糖的最佳提取工藝為A4B2C3D2E1，即纖維素酶與底物質量比1.2%，超聲時間40min，超聲溫度55℃，浸提pH5.0，超聲功率300W。由極差R的大小，可以看出影響多糖提取率的因素依次為A>D>B>E>C，即纖維素酶與底物質量比>pH>超聲時間>超聲功率>超聲溫度。

表2 L16（45）正交實驗設計及結果Table 2 The orthogonal table L16（45）and experimental results

表3 多糖提取率方差分析表Table 3 Polysaccharide yields in the variance analysis

通過進一步的方差分析（表3）可以看出：A因素和D因素對多糖提取率具有顯著性影響，說明纖維素酶與底物質量比和浸提溶液的pH對多糖提取率起主要作用，B、C、E因素則沒有顯著性差異，即超聲時間、超聲溫度和超聲功率對多糖的提取率影響最小。

同樣，由表2可知皂苷的最佳提取工藝為A1B2C3D2E1，即纖維素酶與底物質量比0.6%，超聲時間40min，超聲溫度55℃，浸提pH5.0，超聲功率300W。由極差R的大小可以得出影響皂苷提取率的因素依次為A>E>D>C>B，即纖維素酶與底物質量比>超聲功率>pH>超聲溫度>超聲時間。

表4 皂苷提取率方差分析表Table 4 Sibiricoside yields in the variance analysis

由表4方差分析可知：A因素、D因素以及E因素對皂苷提取率具有顯著性影響，說明纖維素酶與底物質量比、浸提溶液的pH和超聲功率對皂苷提取率起主要作用，B、C因素則沒有顯著性差異，即超聲時間、超聲溫度對皂苷的提取率影響較小。

從以上各表分析中可以看出影響多糖和皂苷提取率的主要因素是纖維素酶與底物質量比、浸提液pH以及超聲功率，超聲時間和超聲溫度的影響相對小一些。因素A在對多糖和皂苷的影響因素中均列第一位，從綜合提取的角度考慮，A3即纖維素酶與底物質量比1%時多糖和皂苷的提取率都較高，故A3為理想條件；因素B、C、D、E對多糖和皂苷的影響的最佳條件都相同，因此選取B2C3D2E1為最佳條件。所以最終的最佳提取條件為A3B2C3D2E1，即纖維素酶與底物質量比1%，超聲時間40min，超聲溫度55℃，浸提pH5.0，超聲功率300W。

2.4 驗證實驗

在此優化條件下進行3次平行驗證實驗，結果見表5。從表5中可知多糖平均提取率為39.36%；皂苷平均提取率為11.69%。

表5 驗證實驗結果Table 5 Verification results of extraction

2.5 方法對比

從表6可以看出，相比較傳統水浴提取方法，超聲波協同纖維素酶對多糖和皂苷的提取率有較大的提高，多糖提取率提高62.44%，皂苷提取率提高59.70%。同時對比單一的超聲波和加酶法可以發現，超聲波和纖維素酶的協同作用明顯優于單一處理作用。

表6 不同方法對比Table 6 Comparison of different methods

3 結論

采用超聲波協同纖維素酶方法，通過單因素和正交實驗，得出提取黃精多糖和皂苷最佳綜合條件為：纖維素酶與底物質量比1%，超聲時間40min，超聲溫度55℃，浸提pH5.0，超聲功率300W。相比傳統水浴提取方法，超聲波協同纖維素酶方法提取時間短，效率高，但在實際工業生產中，生產成本要相對高一些。

[1]祝凌麗，徐維平.黃精總皂苷和多糖的藥理作用及其提取方法的研究進展[J].安徽醫藥，2009，13（7）：719-722.

[2]Chol SB，Park SA.Steroidal glycoside from Polygonatumodoratum（Mill.）druce.Improves insulin resistance but does not alter insulin secretion in 90%pancreatectomized rats[J].Biosci Biotechnol Biochem，2002，66（10）：2036-2043.

[3]Wang Z，Zhou JB，Ju Y，et al.Effects of two saponins extracted from thePolygonatumzanlanscianensepamp on thehuman leukemia（HL60）cells[J].Biol Pharm Bull，2001，24（2）：159-162.

[4]Cai J，Lium J，Wag Z，et al.Apoptoais induced by dioscin in Hela cells[J].Biol Pharm Bull，2002，25（2）：193-196.

[5]王冬梅，朱瑋，張存莉，等.黃精化學成分及其生物活性[J].西北林學院學報，2006，21（2）：142-145.

[6]Wu SR，Li YY，Xiao S.Experimental study of the effect of polygona polysaccharose on hypedipoidemia[J].Chin J New Drugs，2003，12：108-110.

[7]尤新軍，郭蕊，王琳，等.黃精總皂苷超聲提取工藝研究[J].西北林學院學報，2010，25（3）：163-166.

[8]范書珍，陳存武，王林.多花黃精總皂甙的提取研究[J].皖西學院學報，2001，21（5）：39-41.

[9]夏泉，謝勇忠，黃趙剛，等.正交設計優化黃精多糖的水提醇沉工藝[J].中國藥師，2006，9（10）：905-906.

[10]張瑞堂，石曉峰，馬趣環，等.微波輔助提取黃精多糖的工藝研究[J].中國藥師，2009，12（12）：1733-1734.

[11]魏明，邵平，姚紅，等.超聲波協同纖維素酶法提取霍山石斛多糖的研究[J].食品工業科技，2009，30（3）：199-201.

[12]李紹平，黃趙剛，張平，等.蒽酮-硫酸法測定亮菌糖漿中多糖的含量[J].中草藥，2002，33（3）：233-234.

[13]彭愛紅，熊何健，顏宇航.太子參總皂苷的含量測定方法研究[J].四川師范大學學報：自然科學版，2006，29（6）：743-746.

[14]Mohammad H E，Christian P.A combination of ultrasound and oxidative enzyme：sono-biodegradation of substituted phenols [J].Ultrasonic Sonochemistry，2003，10（4/5）：241-246.

Study on the extraction of polysaccharides and sibiricoside from polygonatum（polygonatumcy-rtonema hua）with cellulase enzyme under ultrasonic wave

TAO Tao，LI Li-xiang*，ZHANG Fang，LI Hui
（Key Lab of Tea Biochemistry&Biotechnology，Ministry of Education and Ministry of Agriculture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

To use Jiuhuashan Polygonatum（Polygonatum cy-rtonema Hua）as raw material and water as solvent，synthetically of polysaccharides and sibiricoside was extracted from Polygonatum with cellulase enzyme under ultrasonic wave.The effect of the quality ratio of enzyme to substrate，ultrasonic time，ultrasonic temperature，pH，ultrasonic power on the extraction of polysaccharides and sibiricoside were investigated by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the quality ratio of enzyme to substrate was the most significant factor affecting the synthetic extraction yield，the pH and ultrasonic power were the next place，and extraction temperature and extraction time effects were the least.The optimum extraction conditions were as follows：the quality ratio of enzyme to substrate 1%，ultrasonic time 40min，ultrasonic temperature 55℃，extraction pH5.0，ultrasonic power 300W.Under this condition，the yield of polysaccharides and sibiricoside were 39.36% and 11.69%respectively.The extraction rate of polysaccharides and sibiricoside had been greatly improved which compared to conventional extraction methods.

Polygonatum；ultrasonic wave；cellulase enzyme；polysaccharides；sibiricoside

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0271-05

黃精是多年生的百合科草本植物，又名雞頭參、老虎姜、野生姜等。黃精產地很廣，唯產于九華山最佳，有“北有長白山人參，南有九華山黃精”之稱。近年來，隨著人們對黃精屬植物的研究不斷深入，已從該屬植物中分離得到很多化學成分：糖類、甾體皂苷類、黃酮類等[1]，其中皂苷生物活性研究多集中在降血糖[2]、抗腫瘤[3-4]、抗HIV等方面。黃精多糖研究較

2011－08－22 *通訊聯系人

陶濤（1985-），女，碩士研究生，主要從事茶學與天然產物研究。

國家林業公益性行業科研專項項目（201004055）。多，其藥理活性廣泛，具有增強免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等多種生物學活性[5-6]。目前已有提取黃精多糖或皂苷的相關報道[7-10]，但綜合提取兩者及利用酶提取方法的文章未有報道。超聲法在中藥提取中具有簡單、效率高、副產物少等特點，能達到比常規提取更理想的效果。中草藥的細胞壁主要由纖維素構成，纖維素酶能特異性降解纖維素，破壞細胞壁，使細胞內物質最大限度地溶出。據相關研究，超聲波和纖維素酶有協同作用，共同使用，能獲得更大的提取率[11]。本文用九華山三年生黃精為原料，水為溶劑，采用超聲波協同纖維素酶方法，確定最佳綜合提取多糖和皂苷的工藝，為更好利用九華山黃精提供理論依據。