醇提和堿提板栗殼色素粗提物抗氧化活性比較研究

戚建華，姚增玉，，*，王力華

（1.西南林業大學西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南昆明650224；2.中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧沈陽 110016）

醇提和堿提板栗殼色素粗提物抗氧化活性比較研究

戚建華1，姚增玉1，2，*，王力華2

（1.西南林業大學西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南昆明650224；2.中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧沈陽 110016）

板栗殼色素兼具著色劑和抗氧化劑的雙重作用，分別以70%乙醇和氨水（pH11）為溶劑提取板栗殼色素，對2種提取方法在色素的得率、紫外-可見光光譜以及抗氧化活性方面作了比較研究，以期為板栗殼色素的開發利用提供理論依據。醇提法所得色素色價較高，但在抗脂質過氧化、清除羥自由基和1，1-二苯基-2-苦基肼自由基活性以及還原力方面都不及堿提法所得色素，兩種方法所得色素對超氧陰離子自由基的清除能力都很弱。

板栗殼，色素，抗氧化，溶劑

我國是板栗（Castanea mollissima）生產的第一大國[1]，板栗殼為栗子加工過程中產生的廢棄物，棕褐色的板栗殼中富含天然色素。我國學者在板栗殼色素的提取方法、分級、精制、穩定性、抗氧化活性、抑菌活性、印染性能等方面作了許多研究[2-9]，該色素用作食品添加劑時兼具著色劑和抗氧化劑的雙重作用。根據提取溶劑不同，可將板栗殼色素的提取方法分為稀醇提?。ù继幔┖拖A水溶液提?。▔A提）兩類，但迄今尚無有關兩類提取方法所得色素抗氧化活性方面的對比研究。本研究分別以70%乙醇和稀氨水（pH 11）為溶劑提取板栗殼色素，對其提取得率、色價以及抗氧化活性等方面作了系統的比較研究，以期為板栗殼色素的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

板栗果實 購于陜西楊凌農貿市場，手工剝取板栗殼，將板栗殼用去離子水洗去灰塵和殘余果肉后60℃烘干，粉碎過40目篩備用；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH·） 購自A lfa Aesar公司（德國）；其它試劑 均為國產分析純，除鄰苯三酚用前通過升華純化外，其它試劑不經純化直接使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 色素的提取 在2個三角瓶中各裝入5g板栗殼，分別加入70%乙醇溶液和pH 11的氨水溶液100m L，用膠塞封口后置于65℃水浴中，12h后取出三角瓶，冷卻至室溫后以紗布粗濾，濾液以5000r/min離心30m in，上清液用旋轉蒸發儀濃縮后真空干燥。干燥后的色素稱重并研磨成粉末，裝入瓶中備用。

1.2.2 試樣溶液的配制 稱取色素0.100g放入三角瓶中，加入約70m L去離子水，滴加約5m L濃氨水，搖勻后放入45℃搖床中振蕩至色素完全溶解，用旋轉蒸發儀抽去多余氨水，然后將溶液完全轉移至100m L容量瓶，以去離子水定容，置4℃冰箱中保存，用前稀釋至所需濃度?？箟难崛芤褐苯佑萌ルx子水配制。

1.2.3 紫外－可見光光譜分析 紫外－可見光光譜以UV1101型紫外－可見分光光度計（上海天美）掃描，試樣濃度8mg/L。

1.2.4 抗氧化能力測定

1.2.4.1 抗脂質過氧化能力的測定 參照文獻[10]的方法。用0.1mol/L pH 7.45的磷酸鹽緩沖液（PBS）配制卵黃懸液[V（卵黃）∶V（PBS）=1∶200]，在試管中吸取卵黃懸液1.7m L，加入0.1m L不同濃度的試樣（25、50、100、200mg/L），混勻后加入0.2m L 25mmol/L的FeSO4，37℃恒溫振蕩15m in，取出后加入0.5m L 200g/L的三氯乙酸，3500r/m in離心10m in，吸取2m L上清液加入8g/L的硫代巴比妥酸1m L，加塞后沸水浴15m in，冷卻后測定532nm處吸光度；不加樣品管的吸光度為A0，樣品管的吸光度為A，試樣對脂質過氧化的抑制率（%）按下式計算：

1.2.4.2 清除羥自由基（·OH）活性測定 采用鄰二氮菲－Fe2+氧化法[11]。a.向15m L試管中依次加入0.75mmol/L鄰二氮菲溶液1m L，PBS（0.2mmol/L，pH 7.4）2m L和去離子水1m L，充分搖勻后加入0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液1m L，混勻后再加0.01%H2O21m L，于37℃下溫育60m in，測定532nm處吸光度，其值稱Af。b.同a，唯其中用去離子水代替H2O2，測得的吸光度稱A0。c.用不同濃度（25、50、100、200mg/L）試樣代替a中的去離子水，測得的吸光度稱Ax。d.同a，唯其中用試樣代替H2O2，測得的吸光度稱As。自由基清除率（%）按下式計算：

1.2.4.3 清除超氧陰離子自由基（O2－·）活性的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定[12]。在比色管中加入5m L Tris－HCl緩沖液（50mmol/L，pH 8.2）和0.5m L不同濃度（25、50、100、200mg/L）的試樣溶液，混勻并在25℃下反應10m in，從中取出3m L放入比色杯，加入75μL鄰苯三酚溶液（10mmol/L，以10mmol/L HCl為溶劑）?；靹蚝罅⒓礈y定325nm處的吸光度，然后每隔30s測定一次。以吸光度對時間作圖，所得直線斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率常數（K），以不加試樣為陰性對照。

式中，Ks和K0分別為加入試樣和對照的鄰苯三酚自氧化速率常數。

1.2.4.4 清除二苯代苦味?；杂苫―PPH·）活性的測定 參照文獻[13]的方法并略有改動。0.2m L各濃度的試樣（25、50、100、200mg/L）與5m L 0.1mmol/L DPPH·甲醇溶液混合，室溫下遮光放置3h后測定其在517nm下的吸光度。清除率（%）按下式計算：

式中，A0為未加樣液時的吸光度測定值，As為加樣液吸光度測定值。

1.2.4.5 還原力測定 參照Oyaizu[14]的方法測定。取1m L不同濃度的試樣溶液（25、50、100、200mg/L），再加入200mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1%K3Fe（CN）6各2.5m L，混勻后于50℃反應20m in。取出后再加入2.5m L 10%三氯乙酸混勻，5000r/m in離心10m in。取上層溶液2.5m L加入蒸餾水2.5m L，0.1%FeCl30.5m L，37℃溫育10min，取出冷卻至室溫后測定700nm處吸光度，吸光度值越大，表示樣品的還原能力越強。

1.2.5 總多酚含量的測定 采用Folin－Ciocalteu法[15]并略有改動，其值用沒食子酸含量表示（mg/g）。取100mg/L的板栗殼色素溶液0.5m L加入試管中，再加入0.2mol/L的Folin－Ciocalteu試劑5m L，搖勻并在室溫下靜置5～8m in。然后加入75mg/L Na2CO3溶液4.5m L，搖勻后室溫下靜置2h，最后3000r/m in離心10m in，測定上清液在760nm處的吸光度。同時以0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mmol/L的沒食子酸標準溶液代替色素溶液制作標準曲線，以去離子水代替色素作為空白對照調零。

1.2.6 數據分析 每個處理均重復3次，結果以其平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 色素提取得率和紫外-可見光光譜

本研究分別以70%乙醇和稀氨水（pH11）為溶劑來提取板栗殼色素，其得率分別為（41.2±3.6）mg/g和（164.8±14.5）mg/g。不同提取溶劑所得色素的紫外—可見光光譜如圖1所示，都是一條從200～800nm吸光度逐漸降低的曲線，在可見光區無吸收峰。板栗殼色素在270～280nm處有一肩峰，通常該峰被認為是由結合于色素上的蛋白質中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等的苯環引起的[16]。堿提法雖然色素得率高于醇提法，但所得色素吸光度低于醇提法（圖1），即前者色價（400nm=16.3）低于后者（400nm=26.3），可能的原因有兩個方面：一是以氨水作為溶劑時提取出來的雜質較多，二是氨水提取出的色素組分本身色價較低。堿提法雖然色素得率高但色價低，醇提法正好相反，將色價與得率相乘，前者為2686.24，后者為1083.56，即相同質量的板栗殼色素堿提法得到的色素著色的總效果要比醇提法好，因此在添加量允許的條件下可以通過增加堿提色素的用量來增加著色效果，若要以較低量的色素達到較好的著色效果，則可選用醇提色素。

圖1 醇提和堿提板栗殼色素的紫外－可見光光譜Fig.1 Ultraviolet－visible light spectra of the ethanol and the alkaliextracted chestnut shell pigments

2.2 色素的抗脂質過氧化能力

本研究以卵黃脂蛋白溶液為脂質過氧化體系，測定了堿提和醇提板栗殼色素的抗脂質過氧化能力，結果如圖2所示。從圖2中可以看出，2種板栗殼色素對Fe2+誘導的卵黃脂蛋白脂質過氧化均具有一定的抑制作用，且具有量效性，堿提色素較醇提色素活性略高，但不及抗壞血酸。

圖2 醇提和堿提板栗殼色素的抗脂質過氧化活性Fig.2 Anti-lipid peroxidation activity of the ethanol and the alkaliextracted chestnut shell pigments

2.3·OH清除能力

·OH是目前所知活性氧中對細胞損傷程度最大的一種，可以通過電子轉移、脫氫或者加成等方式與生物體內的多種分子作用，造成氨基酸、蛋白質、核酸、糖類和脂類等物質的氧化損傷，使細胞壞死或突變[17-18]。兩種溶劑提取所得板栗殼色素均具有較強的·OH清除活性（圖3），且在實驗的濃度范圍內，各抗氧化劑對羥自由基的清除率都隨抗氧化劑濃度的增大而提高，堿提色素較醇提色素活性略高，但不及抗壞血酸。吳雪輝等[2]研究表明，醇提板栗殼色素對·OH清除活性不具量效性，且清除率較低（<30%），但何玲玲等[3，19]的研究結果與本研究一致，無論是醇提法還是堿提法所得色素對·OH的清除率均具有量效性。

圖3 醇提和堿提板栗殼色素的·OH清除活性Fig.3 ·OH scavenging activity of the ethanol and the alkali extracted chestnut shell pigments

兩種提取方法所得板栗殼色素對O2-·的清除能力都很弱，遠低于抗壞血酸（圖4）。吳雪輝等[2]研究表明，醇提板栗殼色素對O2-·有一定的清除活性，但何玲玲等[3，19]的研究結果與本研究一致，無論是醇提法還是堿提法所得色素對O2-·均無顯著的清除作用。

圖4 醇提和堿提板栗殼色素的·清除活性Fig.4 ·scavenging activity of the ethanol and the alkali extracted chestnut shell pigments

2.5 DPPH·清除能力

通過紫外檢測器來檢測DPPH·被捕捉的程度，可以評價試樣的抗氧化能力。如果試樣能將其清除，則表明其具有降低烷基自由基、過氧化自由基、羥基自由基的能力和打斷脂質過氧化鏈式反應的作用[11]。兩種溶劑提取得到的板栗殼色素對DPPH·均有很強的清除能力，其活性均高于抗壞血酸，其中堿提色素的活性略高于醇提色素（圖5）。

圖5 醇提和堿提板栗殼色素的DPPH·清除活性Fig.5 DPPH·scavenging activity of the ethanol and the alkali extracted chestnut shell pigments

2.6 還原力

物質的還原能力是潛在的抗氧化性能的重要體現[14]，因此通常也將還原力作為評價抗氧化劑性能的指標之一。由圖6可以看出，2種方法提取得到的板栗殼色素還原力都低于抗壞血酸，堿提色素還原力略高于醇提色素。

圖6 醇提和堿提板栗殼色素的還原力Fig.6 Reducing power of the ethanol and the alkaliextracted chestnut shell pigments

2.7 總多酚含量

多酚類化合物是植物體的次生代謝產物，大多數的多酚類物質都具有非常強的抗氧化活性。本研究采用福林酚比色法對兩種提取方法所得板栗殼色素的總多酚含量進行了測定。醇提法和堿提法所得色素的總多酚含量分別為（1.14±0.02）mg/g沒食子酸當量和（1.09±0.01）mg/g沒食子酸當量，雖然前者總多酚含量高于后者，但在抗脂質過氧化能力、清除·OH、DPPH·活性以及還原力方面都不及后者，可能是堿提法所得提取物成分較為復雜，其中的一些非酚類成分在抗氧化中起著重要作用。

3 結論

抗氧化劑在食品防腐和醫療保健方面起著重要作用，在食品中加入著色劑是改善食品感官性能的主要方法之一，化學合成的抗氧化劑和著色劑對人體潛在的許多不良影響越來越受到關注，人們更崇尚天然產物。板栗殼色素來自食品加工廢棄物，兼具著色劑和抗氧化劑的雙重作用，根據所用溶劑不同，其提取方法可以分為堿提和醇提兩類，本研究對這兩類提取方法在色素的提取得率、紫外-可見光光譜以及抗氧化活性方面作了系統的比較研究。醇提法所得色素色價較高，但在抗脂質過氧化能力、·OH、DPPH·清除活性以及還原力方面都不及堿提法所得色素。

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Com parison of antioxidant activities of crude pigments extracted from chestnut shellby ethanoland alkali

QI Jian-hua1，YAO Zeng-yu1，2，*，WANG Li-hua2

（1.Key Laboratory for Forest Resource Conservation and Utilization in the SouthwestMountains of China，Ministry of Education，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China；2.Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，China）

Chestnut shell pigments can p lay a dual role as a colorant and antioxidant.To p rovide the theoretical information for the utilization of the p igments，70%ethanoland aqueous solution of ammonia（pH11）were used as solvents，and pigment yields，ultraviolet-visib le light spec tra and antioxidant activities of the p igments obtained were com pared.The pigmentextracted by the ethanolhad a higher color value than that by the alkali. However，the anti-lipid peroxidation，removal efficiency to hyd roxyl and 1，1-diphenyl-2-p icryl-hyd razyl radicals，and reducing power for the p igment extracted by the ethanol were lower than that by the alkali.In add ition，the superoxide anion radicalscavenging activity of bothmethods was very weak.

chestnut shell；p igment；antioxidant；solvent

TS201.2

A

1002-0306（2012）09-0104-04

2011－04－21 *通訊聯系人

戚建華（1977-），女，博士，講師，研究方向：生物資源利用。

沈陽市科技計劃項目（1081283-9-00）；教育部重點實驗室科研基金項目（KLESWFU-1101）。