超聲波提取接骨草花中烏索酸的工藝研究

李愛民，姚元枝，陳 鎮，劉香成

（1.懷化學院生命科學系，湖南懷化 418008；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，懷化學院，湖南懷化418008；3.湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室，懷化學院，湖南懷化 418008）

超聲波提取接骨草花中烏索酸的工藝研究

李愛民1，2，3，姚元枝1，2，3，陳 鎮1，劉香成1

（1.懷化學院生命科學系，湖南懷化 418008；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，懷化學院，湖南懷化418008；3.湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室，懷化學院，湖南懷化 418008）

利用超聲波輔助提取法提取接骨草花中烏索酸。通過考察乙醇濃度、固液比、超聲波時間對提取烏索酸得率的影響，設計正交實驗，得出最佳提取工藝。結果表明各因素對提取烏索酸的影響依次為乙醇濃度＞固液比＞超聲時間。最佳提取工藝是乙醇濃度為80%，固液比為1∶60g/mL，提取時間為45min。在此條件下，烏索酸在盛花期中得率為0.83%，在花蕾期中得率為0.81%。

接骨草，烏索酸，超聲波提取

接骨草（Sambucus chinensis Lindl.），別名蒴藋、陸英，屬忍冬科接骨木屬植物，為高大草本或半灌木，在秦嶺以南各省區廣泛分布。全草入藥，可治跌打損傷，有去風濕、通經活血、解毒消炎的功效[1-2]，此外，還具有食用價值[2]。接骨草中含烏索酸、綠原酸、齊墩果酸、α-香樹酯醇、β-谷甾醇等多種活性成分，其中烏索酸含量最高[3-5]。烏索酸（ursolic acid）又名熊果酸，具有廣泛的生物活性，尤其在抗腫瘤、抗氧化、抗菌抗病毒、保肝和美容護膚等方面的作用顯著[6-7]，目前僅有李開泉等人利用回流提取法從接骨草全草中進行了提取烏索酸的工藝研究[8-9]。據考證，接骨草莖葉或根入藥謂“蒴藋”，而花入藥謂“陸英”，二者味性、毒性不同[10]。本研究以接骨草花為原料，通過采用單因素和正交實驗優化超聲波提取工藝，為進一步提升接骨草的利用價值及為工業化生產烏索酸奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

接骨草花 采自湖南省懷化市；烏索酸標準品中國生物藥品制品檢驗所；甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、高氯酸、香蘭素等 均為國產分析純。

HH-601超級恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；YELA DSB-2000型旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；SL-N系列電子天平 上海民橋精密科學儀器公司；JY98-ⅢDN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；U800貝克曼紫外/可見光分光光度計 美國貝克曼儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烏索酸的提取 準確稱取過60目篩的接骨草花粉末1g，用不同濃度的乙醇、不同的料液比浸泡24h后，超聲波提取，3000r/m in離心得提取液。旋轉蒸發，用甲醇定容于100m L定量瓶，再次離心得上清液。取5m L于10m L定容管中，再取2m L于10m L定容管中作為測試樣品液，在烏索酸的最大吸收波長（542nm）處測定吸光度。對照實驗的操作及條件除未采用超聲波外，其余和超聲提取最佳條件相同。

1.2.2 烏索酸得率的測定

1.2.2.1 標準曲線的制作 參照丁紅[11]和魏福有[12]的方法。精確稱取烏索酸標準品10mg，甲醇定容至100m L，即得0.1mg/m L烏索酸標準溶液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2m L于10m L具塞試管中，揮去溶劑，分別加入0.6m L 5%香蘭素-冰醋酸，1.4m L高氯酸，60℃水浴保溫10m in，取出冷卻，加入乙酸乙酯定容至10m L，用0.2m L標準品溶液及烏索酸空白為對照，在波長400～800nm下做掃描，選取最適波長。然后在最適波長下以空白試劑為對照，以吸光度為縱坐標，烏索酸濃度為橫坐標，檢測吸光值，繪制標準曲線為：Y=0.0558X-0.0036，R2=0.9995。烏索酸濃度在2～12μg/m L范圍內呈良好線性關系。

1.2.2.2 烏索酸得率的計算 W（%）=（100X×V×f/ 1000m）×100%，式中：X為由標準曲線計算出的烏索酸濃度（μg/m L），V為樣品供試液的體積（m L），f為稀釋倍數，m為接骨草花樣品質量（mg）。

1.2.2.3 精密度 精密吸取烏索酸標準液0.2m L五份，進行五次平行實驗測定烏索酸的吸光值，結果吸光值的RSD為1.97%。

1.2.3 超聲波提取條件的優化

1.2.3.1 乙醇濃度的選擇 精確稱取1g樣品五份，分別準確加入30%、50%、70%、80%和95%乙醇30m L，料液比為1∶30g/m L，密封浸泡24h，超聲波提取30m in，離心取上清液再旋轉蒸發，轉移至100m L容量瓶中，加甲醇定溶，再次離心。精密吸取上清液5.0m L置于10m L具塞試管中，再取2m L置于10m L具塞管中，加熱揮去溶劑后，在542nm處測定吸光度，計算浸出率。

1.2.3.2 料液比的選擇 精確稱取1g樣品五份，分別準確加入70%乙醇10、15、25、40、60m L，即料液比（g/m L）為1∶10、1∶15、1∶25、1∶40、1∶60，密封浸泡24h，超聲波提取30m in，離心取上清液再旋轉蒸發，轉移至100m L容量瓶中，加甲醇定溶，再次離心。精密吸取上清液5.0m L置于10m L具塞試管中，再取2m L置于10m L具塞管中，加熱揮去溶劑后，在542nm處測定吸光度。計算浸出率。

1.2.3.3 超聲波提取時間的選擇 精確稱取1g樣品五份，分別準確加入70%乙醇30m L，料液比為1∶30g/m L，密封浸泡24h，分別超聲波提取15、20、30、45、60m in后離心，取上清液再旋轉蒸發，轉移至100m L容量瓶中，加甲醇至刻度，再次離心。精密吸取上清液5.0m L置于10m L具塞試管中，再取2m L置于10m L具塞管中，加熱揮去溶劑后，在542nm處測定吸光度。計算浸出率。

1.2.3.4 超聲波提取法正交優化實驗 選L9（34）作正交實驗，選定提取接骨草花中烏索酸的最佳提取參數，乙醇濃度A（%）、料液比B（g/m L）和超聲波提取時間C（m in）。在542nm處測定吸光度，計算浸出率。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 不同狀態花中烏索酸含量 根據正交實驗所得的最佳超聲波提取工藝對盛花期花和花蕾期花中烏索酸含量進行對比。精確稱取已開放花和花蕾1g樣品各三份，分別準確加入80%乙醇60m L料液比為1∶60g/m L，密封浸泡24h后，分別超聲波提取30m in后離心，取上清液再旋轉蒸發，轉移至100m L容量瓶中，加甲醇至刻度，再次離心。精密吸取上清液5.0m L置于10m L具塞試管中，再取2m L置于10m L具塞試管中，加熱揮去溶劑后，在542nm處測定吸光度。計算浸出率。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對烏索酸得率的影響

結果見圖1。在低乙醇濃度時，烏索酸得率隨著乙醇濃度的增大而增加，在乙醇濃度接近80%時，烏索酸得率達到最大，隨后烏索酸得率隨乙醇濃度的增加而下降。

圖1 乙醇濃度對烏索酸得率的影響Fig.1 Effectof extraction rate of ursolic acid by different concentrations of ethanol solvent

2.2 料液比對烏索酸得率的影響

結果見圖2。隨著料液比的增加，烏索酸的得率也逐漸增加，在料液比為1∶60時，烏索酸得率最高?？紤]到經濟實用的因素，之后的實驗所用料液比最大為1∶60。

2.3 超聲時間對烏索酸得率的影響

結果見圖3。烏索酸得率隨超聲波提取時間的延長而增加，當超聲時間達到60m in時，烏索酸得率達到最高。為防止烏索酸長時間受熱發生結構變化，影響產品的純度，提高工藝過程效率，提取時間適當控制在30～45m in。

圖2 料液比對烏索酸得率的影響Fig.2 Effectof extraction rate of ursolic acid by different solid to liquid ratio

圖3 超聲波提取時間對烏索酸得率的影響Fig.3 Effect of extraction rate of ursolic acid by ultrasonic extraction time

2.4 正交實驗結果與分析

從表2可得知，乙醇濃度和料液比的極差R較大，所以乙醇濃度和料液比對測定的影響大，而超聲時間對測定影響相對較小。同時結果表明，各因素對烏索酸浸出率影響大小次序為：A（乙醇濃度）＞B（料液比）＞C（超聲時間），由直觀分析和單因素實驗結果考慮，最佳方案為A3B3C2，即提取的乙醇濃度為80%、提取的料液比為1∶60g/m L、提取時間為45m in。

表2 正交實驗設計及結果Table 2 Orthogonal test design and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.5 不同狀態花中烏索酸的得率

從圖4可得知，用超聲波最佳提取工藝提取盛花期及花蕾期中的烏索酸，烏索酸在盛花期中得率為0.83%，花蕾期中得率為0.81%。

圖4 不同時期花中烏索酸得率Fig.4 Extraction rate of ursolic acid in different developmental stage flowers

3 結論

3.1 通過實驗獲得了超聲波提取接骨草花中烏索酸的最佳工藝，各因素對烏索酸得率的影響依次為乙醇濃度＞料液比＞超聲時間。最佳工藝條件是乙醇濃度為80%，料液比為1∶60g/m L（考慮經濟性可選1∶40g/m L），提取時間為45min。李開泉等[8－9]曾對乙醇回流法從接骨草全草中提取烏索酸的工藝條件進行了優化，發現利用7倍量的90%乙醇加熱回流2次，每次1h，對干品的提取率可達到90%以上。我們利用超聲波輔助提取，可將提取時間縮短至30min，能大大提高生產效率。

3.2 據研究[5]，不同產地的接骨草，烏索酸的含量有差異。同一產地的接骨草，根、莖、葉中烏索酸的含量也不同，其含量多在0.3689～1.6857mg/g之間。按照最佳工藝條件提取接骨草花中烏索酸，發現烏索酸在盛花期中得率為0.83%，花蕾期中得率為0.81%。為接骨草的綜合開發利用提供新依據。

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Study on ultrasonic-assisted extraction technology for ursolic acid from Sambucus chinensis flowers

LIAi-m in1，2，3，YAO Yuan-zhi1，2，3，CHEN Zhen1，LIU Xiang-cheng1
（1.Departmentof Life Sciences，Huaihua University，Huaihua 418008，China；2.Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province，Huaihua University，Huaihua 418008，China；3.Key Laboratory of XiangxiMedicinal Plantand Ethnobotany of Hunan Higher Education，Huaihua University，Huaihua 418008，China）

The extraction technology ofursolic acid from Sambucus chinensis flowerswas op tim ized by ultrasonicassisted extraction.Effects of concentration of ethanol，ratio of raw material to liquid，ultrasonic extrac tion time were stud ied by orthogonal experimentmethods.The results showed that the effect sequence of three main factors for ursolic acid yield were as follows：ethanol concentration，solid to liquid ratio，ultrasonic extraction time.The op timal extraction cond itions were 80%ethanol，solid to liquid ratio 1∶60g/m L，ultrasonic extraction time 45m in.Ursolic acid yield in open and not open flowers under the op timal ultrasonic extraction condition were 0.83%，0.81%respectively.

Sambucus chinensis Lind l.；ursolic acid；ultrasonic-assisted extrac tion

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0234-04

2011－08－08

李愛民（1968-），男，博士，副教授，研究方向：植物資源開發與利用。

湖南省教育廳科學研究項目（10C1062）；湖南省科技計劃項目（2011NK3045）。