水體中基因組提取方法的比較及水體中銅綠假單胞菌檢測技術的研究

張淑紅，許文濤，2，石 慧，程國靈，羅云波，2，黃昆侖，2，*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心（北京），北京 100083）

水體中基因組提取方法的比較及水體中銅綠假單胞菌檢測技術的研究

張淑紅1，許文濤1，2，石 慧1，程國靈1，羅云波1，2，黃昆侖1，2，*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心（北京），北京 100083）

以河水為研究對象，采用沸水浴法、SDS法、CTAB法、酚氯仿法和改良法提取河水中的基因組，對提取效果進行比較，確定出最佳提取方法；并利用傳統培養法和分子生物學方法對人工污染樣品中的銅綠假單胞菌進行檢測，對兩種方法檢測結果進行比較；最后實驗利用4種自然界水體驗證了分子生物學方法的準確性。結果表明加入溶菌酶的酚氯仿法對河水中的DNA提取效果最好；傳統培養法和分子生物學方法檢測結果一致，且分子生物學方法比傳統培養法節省一半左右的時間；用分子生物學方法可以檢測出自然界水體中的銅綠假單胞菌。

河水，提取基因組，傳統培養法，分子生物學方法

銅綠假單胞菌（俗稱綠膿桿菌，Pseudomonas aeruginosa）為條件致病菌，單生鞭毛，運動活潑，無芽胞，專性需氧的革蘭氏陰性桿菌[1]。銅綠假單胞菌是醫院內感染的主要病原之一，也是人類3大機會致病菌之一[2]。同時，銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界中，特別是潮濕的環境[3]、水、泥土、空氣以及人的正常皮膚、腸道、呼吸道和植物體表。銅綠假單胞菌分布廣泛，對不良環境的抵抗力強，在營養缺乏的水中仍然可以生長[4]?！缎掠⒏裉m醫學雜志》發表的兩份研究報告表明，銅綠假單胞菌的水污染問題已經引起了有關專家和醫學管理部門的極大關注，即使是對于通常被認為是非常清潔的水源。加拿大A lberta大學的皮膚病學專家LorettaFiorillo[5]醫學博士在其中的一份報告中將他們發現的一種具有顯著臨床特性的污染爆發稱之為“假單胞菌熱腳綜合癥”，表現為患兒的足部突然發生尖銳的疼痛，隨即出現腫脹、發紅以及灼熱感，這些患兒都是在淺水池玩耍后被感染的。德國學者在另一份報告中則描述了一例臨產婦女因在分娩前洗了熱水盆浴而被感染，盡管這在許多醫院都是一種臨產前的常規處理，但結果卻導致了其新生兒患有假單胞菌腦膜炎。即使經過微生物過濾的瓶裝飲用水，也經常會由于水源污染而在最終產品中檢出銅綠假單胞菌[6]。近年來，醫療機構和衛生防疫站等各質量監督部門越來越重視銅綠假單胞菌的檢測，國標中對于銅綠假單胞菌的檢測使用的是傳統的篩選培養基培養，然后再通過一系列的生化實驗最終確定是否為銅綠假單胞菌。這種方法可以保證較高的準確度，但是耗費的時間較長，約需要3d的時間。ASHRAF[7]等用銅綠假單胞菌特有的外毒素Toxin A基因toxA作為目的基因，設計特異性擴增此基因的引物進行PCR反應，根據凝膠電泳圖譜中目的條帶的出現情況判斷樣品中是否污染銅綠假單胞菌，此方法僅需要6h左右即可出結果；Pieter[8]等用銅綠假單胞菌特有的oprL基因設計特異性引物并做PCR擴增，檢測纖維化病癥患者體內的銅綠假單胞菌；Jaffe[9]等用16S rDNA設計特異性引物檢測銅綠假單胞菌；Lavenir[10]等用oprI基因設計引物；Qin[11]等用algD基因設計引物檢測樣品中的銅綠假單胞菌，得到較高的準確度。本文以自然界中的水體為研究對象，首先比較各種微生物基因組提取方法—沸水浴法、SDS法、CTAB法、酚氯仿法[12]和改良法—對水樣中微生物的提取效果，確定一個最優的提取方法用于后續實驗的研究。然后再對水體中銅綠假單胞菌的傳統培養方法檢測和分子生物學方法檢測進行對比，分別選取已有報道的銅綠假單胞菌外毒素Toxin A的基因toxA和編碼外膜脂蛋白基因oprL設計銅綠假單胞菌的特異性擴增引物，通過定性PCR檢測樣品中的銅綠假單胞菌污染情況，對兩種方法所花時間和結果準確度進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1由中國科學院微生物所馬旅雁教授饋贈；熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）2P24 由中國農業大學農學與生物技術學院張立群教授饋贈；假單胞菌CN選擇性培養基 購于北京陸橋生物技術有限公司；0.2μm微孔濾膜 購于北京藍弋生物技術公司；PCR擴增采用的rTaq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs 購于大連寶生物公司；RNase A酶、DNA Marker DL 2000、普通DNA產物純化試劑盒 購于Tiangen公司；CTAB緩沖液 CTAB20g/L、Tris-HCl 0.1mol/L（pH 8.0）、EDTA 0.02mol/L、巰基乙醇0.04mol/L；氯仿/異戊醇（24∶1，v/v）

取240m L氯仿，10m L異戊醇，混勻備用；（SDS法）提取緩沖液 500mmol/L NaCl、100mmol/L Tris-HCl pH 8、50mmol/L EDTA pH 8.0、10mmol/L 2-巰基乙醇（用前加入）；TE緩沖液 10mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA，pH 8.0；酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1） 取250m L酚、240m L氯仿、10m L異戊醇，混勻備用；水樣 北京市海淀區小月河河水、奧林匹克公園內湖水、奧林匹克森林公園內湖水和小清河河水；十六烷基三甲基溴化銨瓊脂培養基（單位：g/L） 蛋白胨10、牛肉浸粉3、氯化鈉5、瓊脂（液體培養基不加）13、十六烷基三甲基溴化銨0.3，pH 7.5±0.1，蒸餾水1L；70%乙醇、20%SDS（pH7.2）、5mol/L醋酸鉀、異丙醇、10%SDS及其它試劑或溶劑 均為分析純或生化純。

離心機（5804R型）、微量移液器、普通PCR擴增儀 德國Eppendorf公司；電泳儀（DYY-6C） 北京六一儀器廠；凝膠成像儀 Beijing Junyi-Dongfang Electrophoresis Equipment Co.Ltd；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；ASP-3700型紫外分光光度計。

1.2 河水中微生物DNA提取方法的比較與優化

以小月河河水為實驗材料，沿河岸每隔100m取一次水樣，共取4次。濾網過濾，以去除昆蟲、水草等雜物。

1.2.1 沸水浴法 將10m L河水置于離心管，100℃水浴10m in后，12000×g離心5m in，移取上清，加RNA酶2μL，37℃消化30m in，用普通DNA產物純化試劑盒純化DNA，-20℃保存備用。

1.2.2 SDS法 將10m L河水置于離心管，100℃水浴10m in后，12000×g離心5m in，棄上清，加入1.2m L預熱至65℃的提取緩沖液，輕緩振蕩混勻，加入120μL 20%SDS，混勻，在65℃水浴中放置30min，不時顛倒混勻。加入0.45m L 5mol/L的醋酸鉀，混勻，冰浴20m in，10000×g離心20m in。加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕顛倒混勻，12000×g離心15m in。轉移上清液到一新離心管中，加入0.7m L冰預冷異丙醇，-20℃放置30m in沉淀DNA。25℃，12000×g，離心10m in，收集沉淀。棄上清，70%乙醇洗滌一次，徹底去除乙醇，晾干DNA，溶于30μL dd H2O，加RNA酶2μL，37℃消化30m in，用普通DNA產物純化試劑盒純化DNA，-20℃保存備用。

1.2.3 CTAB法 將10m L河水置于離心管，12000×g離心10m in，去上清。加CTAB緩沖液1m L，混勻，65℃水浴20m in。加等體積氯仿/異戊醇（24∶1），離心10m in，取上清置于離心管，重復兩次。加2/3倍體積的異丙醇，放冰箱（-80℃）15min沉淀。離心10min，去上清，加70%乙醇700μL，12000×g離心10m in，沉淀DNA，重復一次，以下操作同1.2.2。

1.2.4 酚、氯仿法 將10m L河水置于離心管，12000×g離心10min，去上清。細菌沉淀加入567μL TE溶液重懸，加入10%SDS 33μL，于37℃溫育1h。加入5mol/L NaCl 100μL，CTAB緩沖溶液80μL，于65℃溫育10m in。加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），混勻，4℃，12000×g離心5min。將上清液轉入另一個離心管中，加等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），混勻，4℃，12000×g離心5m in。提取上清置于另一管，加2/3體積異丙醇，輕柔混合，4℃，12000×g離心5m in，棄上清。加入70%乙醇洗滌1m in，離心，棄上清，以下操作同1.2.2。

1.2.5 改良法 分別對以上SDS法，CTAB法和酚、氯仿法進行改良。稱取0.02g溶菌酶，溶于1m L蒸餾水中。將10m L河水置于離心管，12000×g離心10m in，去上清。加入300μL溶菌酶溶液，37℃水浴過夜。12000×g離心10m in，去上清，以下步驟同上述各方法。

1.2.6 電泳驗證 瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3 人工污染樣品的傳統方法檢測與分子生物學方法檢測的比較

模擬污染水體：活化銅綠假單胞菌PAO1、熒光假單胞菌2P24、大腸桿菌BL21。取滅菌的十六烷基三甲基溴化銨液體培養基，用上述三株菌進行人工污染。三株菌單獨或者任意組合共7種組合結果，分別為：1.銅綠假單胞菌PAO1；2.熒光假單胞菌2P24；3.大腸桿菌BL21；4.銅綠假單胞菌PAO1與熒光假單胞菌2P24混合；5.銅綠假單胞菌PAO1與大腸桿菌BL21混合；6.熒光假單胞菌2P24與大腸桿菌BL21混合；7.銅綠假單胞菌PAO1、熒光假單胞菌2P24與大腸桿菌BL21混合。以未進行人工污染的培養基做對照，每種組合的培養液各取10m L，4℃，12000×g離心10m in，棄上清。加入10m L滅菌的十六烷基三甲基溴化銨液體培養基，振蕩數分鐘，制成人工污染樣品。

1.3.1 人工污染樣品的傳統方法檢測 準備8個平板，倒入假單胞菌CN選擇性瓊脂培養基，取人工污染樣品及對照樣品100μL準備涂板。1號板：銅綠假單胞菌PAO1；2號板：熒光假單胞菌2P24；3號板：大腸桿菌BL21；4號板：銅綠假單胞菌PAO1與熒光假單胞菌2P24混合；5號板：銅綠假單胞菌PAO1與大腸桿菌BL21混合；6號板：熒光假單胞菌2P24與大腸桿菌BL21混合；7號板：銅綠假單胞菌PAO1、熒光假單胞菌2P24與大腸桿菌BL21混合；8號板：未進行人工污染的培養基。37℃恒溫箱培養48h，觀察長出菌的形態。

1.3.2 人工污染樣品的分子生物學檢測 用2m L離心管取出人工污染樣品2m L，改良酚氯仿法提取基因組，分別用引物Toxin A－F/R和OPRL－F/R做PCR擴增驗證。比較傳統培養方法和分子生物學方法檢測結果是否一致，同時比較兩種引物擴增結果是否一致。

表1 引物序列信息Table 1 Information of the primers sequence

表2 PCR擴增反應體系Table 2 The PCR amplification reaction system

擴增反應程序為95℃預變性5m in；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環；72℃延伸7m in。反應結束后，2%瓊脂糖凝膠電泳分析結果。

1.4 分子生物學方法檢測自然界水體中銅綠假單胞菌的應用

分別在小月河河水，奧林匹克公園內湖水，奧林匹克森林公園內湖水和小清河河水4個水體中取樣，在每個水體沿岸取2次樣，共取8個樣，濾網過濾，去除昆蟲，水草等雜物，改良酚氯仿法提取基因組，分別用引物Toxin A－F/R和OPRL－F/R進行PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 幾種不同的基因組提取方法的比較

圖1 未加溶菌酶的各種提取方法提取電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis of bacteria DNA extracted from waterwithout lysozyme

由圖1可以看出，除沸水浴法外，其他三種方法提取的1、2號水樣條帶都較清晰，其中，酚氯仿法提取效果最好。3、4號水樣可能相對污染程度小，所以提取的基因組濃度低，而未跑出條帶。由此可知，不加溶菌酶的SDS法、CTAB法和酚氯仿法對水樣有較理想的提取效果。

圖2 加溶菌酶后的各種提取方法提取電泳圖Fig.2 The agarose gel electrophoresis of bacteria DNA extracted from waterwith lysozyme

由圖2可以看出，加入溶菌酶后，除沸水浴法外用其他三種方法提取4個水樣都可以跑出較清晰的條帶；與未加溶菌酶的圖1相比，提取效果有了明顯的改善，尤其酚氯仿法提取的4個水樣均有清晰條帶出現，效果最好。所以可以首選加溶菌酶的酚氯仿法進行下一步的研究工作。

2.2 樣品的傳統方法檢測與分子生物學方法檢測的比較模型

取已滅菌的十六烷基三甲基溴化銨液體培養基，用經過活化后的銅綠假單胞菌PAO1、熒光假單胞菌2P24、大腸桿菌BL21三種菌株進行人工污染。將3種菌株單獨或者任意組合為共7種組合結果，以未進行人工污染的培養基做對照。然后，將每種組合后的菌液各取10m L，4℃，12000×g離心10min，棄上清。加入10m L十六烷基三甲基溴化銨液體培養基，振蕩數分鐘。

2.2.1 樣品的傳統方法檢測 取各人工污染的樣品和對照樣品100μL，涂于假單胞菌CN選擇性瓊脂培養基上，37℃恒溫箱培養48h，觀察長出菌的形態。由圖3可知，1、4、5和7號板均長出綠色菌落，其余各板無菌落長出，此結果與組合中所含有的菌一致。

圖3 各種人工污染組合的生長情況Fig.3 The growing condition of various combinations by artificial contamination

2.2.2 樣品的分子生物學方法檢測 取人工污染的樣品，用改良酚氯仿法提取基因組，分別用銅綠假單胞菌特異性引物Toxin A－F/R和OPRL－F/R對各樣品進行PCR擴增驗證，2%凝膠電泳分析條帶。

由圖4可知，第1、4、5和7泳道有目的條帶出現，說明第1、4、5和7號組合長出銅綠假單胞菌，與組合中所含有的菌以及傳統培養方法檢測結果一致。

圖4 各種人工組合Toxin A－F/R引物PCR擴增驗證電泳圖Fig.4 PCR detection electrophoresiswith Toxin A－F/R of various combinations by artificial contamination

由圖5可知，第1、4、5和7泳道有目的條帶出現，說明第1、4、5和7號組合長出銅綠假單胞菌。與組合中所含有的菌以及傳統培養方法檢測結果一致，且與圖4檢測結果一致，即證明兩種引物均可以用作銅綠假單胞菌的檢測。

圖5 各種人工組合OPRL－F/R引物驗證電泳圖Fig.5 PCR detection electrophoresiswith OPRL－F/R of various combinations by artificial contamination

綜上所述，傳統培養方法和分子生物學方法檢測均可以準確檢測樣品污染情況。但從所花時間上看，傳統培養完成檢測需要大約48h，即2d的時間；而分子生物學方法完成檢測僅需要8h左右。由此明顯可以看出，與傳統培養方法相比，分子生物學方法檢測在保證準確性的基礎上，可節省大量時間。

2.3 分子生物學方法檢測自然界水體中銅綠假單胞菌的應用

由小月河、奧林匹克公園內、奧林匹克森林公園內和小清河4個水體中取樣，在每個水體沿岸取2次樣，共取8個樣，提取基因組，分別用引物Toxin A－F/R和OPRL－F/R進行PCR擴增，無菌超純水做空白對照。

由圖6可知，小月河2個水樣、奧林匹克森林公園1個水樣和小清河1個水樣進行引物Toxin A－F/R特異性擴增時出現目的條帶。說明這4個水樣遭到銅綠假單胞菌的污染。

圖6 引物Toxin A－F/R擴增驗證8個水樣電泳圖Fig.6 PCR detection electrophoresiswith Toxin A－F/R of 8 water samples

由圖7可知，小月河2個水樣、奧林匹克森林公園1個水樣和小清河1個水樣進行引物OPRL－F/R特異性擴增時出現目的條帶。此結果與圖6一致，再一次證明在實際應用中，引物Toxin A－F/R和OPRL－F/R進行PCR擴增均可以得出準確結果。

圖7 引物OPRL－F/R擴增8個水樣電泳圖Fig.7 PCR detection electrophoresiswith OPRL－F/R of 8 water samples

3 討論

高質量的微生物基因組DNA是基因工程的前提[14]。樣品基因組提取是研究利用PCR技術解決問題的基礎，而不同的樣品基因組提取的難易程度存在很大的差別。通過本實驗研究發現，未加溶菌酶的SDS法、CTAB法和酚氯仿法都可以提取出部分樣品的DNA，而加入溶菌酶的上述各法提取效果均有所改善，尤其是加入溶菌酶的酚氯仿法可以將4個水樣中的DNA都提取出來。所以可以首選加溶菌酶的酚氯仿法進行下一步的研究工作。

用人工污染的樣品作為模型比較傳統培養方法和分子生物學方法檢測水體中銅綠假單胞菌，兩種方法得出的檢測結果一致。但與傳統培養方法相比，分子生物學檢測方法可以節省大量的時間。

取自然界中的水體，用分子生物學方法檢測其中的銅綠假單胞菌。實驗表明，Toxin A-F/R和OPRLF/R兩種引物特異性擴增檢測結果一致，確定出污染銅綠假單胞菌的水樣。

綜上所述，本實驗建立了高效提取水體中的基因組，并且利用分子生物學方法檢測水體中銅綠假單胞菌的方法，較傳統培養方法可以節省大量時間。在得到準確結果的同時，提高了檢測效率。此方法可以為水體污染檢測的研究提供技術參考。

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Com parison of the extraction methods of DNA and study on the biotechnologicaldetection of Pseudomonas aeruginosa in river

ZHANG Shu-hong1，XUW en-tao1，2，SHIHui1，CHENG Guo-ling1，LUO Yun-bo1，2，HUANG Kun-lun1，2，*
（1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.Supervision and Testing Center for GMOs Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China）

Boiling-water method，SDS method，CTAB method，phenol-chloroform method and mod ified method were used to extract DNA from river，then the extracting results were compared to determ ine the bestmethod. Trad itional method and biotechnologicalmethod were used to detect Pseudomonas aeruginosa in sam p les after artificial contam ination，then the results were compared.And the biotechnologicalmethod was used to detect 4 river samp les in nature.The results showed that phenol-chloroform method w ith lysozyme was the bestmethod to extract DNA from river.The same resultwas obtained when detecting the samp les after artificial contam ination using traditionalmethod and biotechnologicalmethod，but the latter saved half the time spent in the former.The biotechnologicalmethod could be used to detect Pseudomonas aeruginosa from river in nature. Key words：river；extract DNA；trad itionalmethod；biotechnologicalmethod

TS207.4

A

1002-0306（2012）09-0375-05

2011－08－16 *通訊聯系人

張淑紅（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

轉基因生物重大專項（2008ZX08012-001）。