動物組織中萊克多巴胺殘留膠體金免疫層析和LC-MS/MS檢測方法的比較

趙彥嶺 張寧 胡自然 陳寶明 萬宇平（河北省獸藥監察所 石家莊 050051 河北省畜牧獸醫研究所 保定 河北省動物疫病預防控制中心 ④北京勤邦生物技術有限公司）

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動物組織中萊克多巴胺殘留膠體金免疫層析和LC-MS/MS檢測方法的比較

趙彥嶺①張寧②胡自然③陳寶明①萬宇平④*（①河北省獸藥監察所 石家莊 050051 ②河北省畜牧獸醫研究所 保定 ③河北省動物疫病預防控制中心 ④北京勤邦生物技術有限公司）

采用膠體金試紙卡法和LC-MS/MS法分別對豬肉、豬肝樣品進行檢測，鑒定膠體金試紙卡法和LC-MS/MS法檢測結果的符合率。結果表明：應用膠體金試紙卡法檢測樣品中萊克多巴胺的最低檢測限為5.0μg/kg，LC-MS/MS檢測方法的檢測限為0.25μg/kg；2種方法的檢測結果一致。膠體金試紙卡法特異性較高，樣品前處理簡單，檢測快速，成本低，適用于動物組織中萊克多巴胺殘留的定性篩查；LC-MS/MS靈敏度高，適合于陽性樣品的確證和精確定量。

萊克多巴胺 動物組織 膠體金試紙卡 液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)

萊克多巴胺(Ractopamine, RAC)，化學名稱為1-(4-羥基苯基)-2[1-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙氨基]-乙醇鹽酸鹽，與克倫特羅(瘦肉精)均為β2受體興奮劑，在臨床上普遍用于治療支氣管炎和哮喘病。近幾年的研究表明，RAC具有控制動物營養代謝路徑、增強飼料轉化率等作用，因此被用作新型促生長添加劑。但由于萊克多巴胺在豬等動物的體內具有殘留并可以通過生物鏈方式進入人體，當積累超過一定量時表現出毒副反應，出現心動過速、心律失常及肌肉疼痛等癥狀[1-3]。近年來，RAC被不法商販作為“瘦肉精”替代品應用于豬養殖業中。我國農業部2002年176號公告將RAC規定為違禁藥物。相應地，對于萊克多巴胺的檢測技術的研究提出了更高的要求。簡單、快速、準確、靈敏的萊克多巴胺檢測技術也越來越受到食品企業、檢測機構的廣泛關注。目前動物組織中萊克多巴胺殘留分析主要采用免疫分析法[4]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[5]、高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)[6]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[7]等方法。膠體金免疫層析法作為一種現場快速篩選方法已受到廣泛重視。為考察目前RAC的快速檢測技術和實驗室大型精密儀器檢測技術的檢測效果，本實驗采用膠體金免疫層析法和LC-MS/MS法對動物組織中萊克多巴胺殘留進行檢測，并對不同兩種檢測方法的檢測結果進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 萊克多巴胺標準品(美國Sigma公司)，純度99%以上；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(美國Sigma公司)，β-葡萄糖醛苷酶含量≥85000units/ml，芳基硫酸酯酶含量≥7500units/ml；萊克多巴胺膠體金試紙卡(北京勤邦生物技術有限公司)；乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基醚、甲酸、氨水(北京化學試劑公司)，分析純；甲醇、乙腈(美國Sigma公司)，色譜純。

1.1.2 儀器 2000SBL電子天平(美國Setra公司)；微量移液器 單道20~200ml和100~1000ml、多道50~300ml(美國Thermo)；8010S勻漿機(上海斯伯明儀器設備有限公司)；QL-90漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；HH-S8恒溫水浴鍋(常州菲普實驗儀器廠)；LC-MS/MS液相色譜-串聯質譜儀 配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur1.2數據處理系統(美國Waters公司)。

1.1.3 試驗用豬肉和豬肝 樣品均為市購，取適量新鮮或冷凍的豬肉、豬肝樣品，結凍，試驗所用豬肉和豬肝攪碎制成均質物，前處理用。

1.2 方法

1.2.1 試驗條件 （1）色譜條件：色譜柱為BEH C18 (100×2.1mm，1.7μm)，柱溫為30℃；流動相A：0.1%甲酸和0.05%氨水溶液，B相：乙腈；流速0.4ml/min；進樣量5μl。（2）質譜條件：離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監測；電離電壓3KV；離子源溫度150℃；脫溶劑溫度400℃；碰撞氣流速 0.15ml/min；錐孔氣流速50L/h；脫溶劑氣流速550L/h。

1.2.2 樣品前處理方法 （1）膠體金試紙卡法：稱取1.0g均質過的豬肉或豬肝樣品于10ml離心管中，加入1ml 0.02mol/L pH為7.4的磷酸鹽緩沖液作為樣品提取液，渦動1min。放入80℃水中水浴15min，取出冷卻至室溫，待檢。（2）LC-MS/MS法：樣品前處理方法參考《農業部1025號公告-18-2008 動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法》中的酶解、提取和凈化步驟進行操作[8]。

1.2.3 測定方法 （1）膠體金試紙卡法：取陽性的豬肉和豬肝樣品分別進行質量濃度為1.0、5.0、10.0μg/L萊克多巴胺標準品的添加，判定膠體金試紙卡的檢測限，每個濃度作3個平行。檢測方法為用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加3滴于加樣孔中，從液體流動時開始計時，反應5~10min判定結果。（2）LC-MS/MS法：取標準品用LC-MS/MS檢測條件進行分析，檢測時間及流動相梯度洗脫情況見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件

1.2.4 結果計算 （1）膠體金試紙卡：用試紙卡檢測樣品時，當樣品為陰性時，試紙卡的T線和C線都顯色，表示樣品中萊克多巴胺濃度低于檢測限；當樣品為陽性時，T線不顯色，表示樣品中萊克多巴胺濃度高于檢測限；當試紙卡為無效時，則C線不會出現。膠體金試紙卡檢測結果判定如圖1所示：（2）LC-MS/MS法：采用外標法對樣品中萊克多巴胺殘留量進行定量分析，以萊克多巴胺標準品的峰面積為軸，以萊克多巴胺標準品質量濃度(μg/L)為軸，分別測定質量濃度為0.0、1.0、5.0和10.0μg/L的萊克多巴胺標準溶液的峰面積，繪制標準曲線。將樣品中峰面積代入標準曲線中，從標準曲線上讀出對應的萊克多巴胺的質量濃度，即為樣品中萊克多巴胺實際殘留量。標準曲線為A=aC+b，求得a和b，則C=(A-b)/a，式中：A—標準品或樣品中萊克多巴胺峰面積；C—標準品或樣品中萊克多巴胺峰濃度。

圖1 膠體金試紙卡檢測結果判定示意圖

2 結果與討論

2.1 LC-MS/MS標準曲線

取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μg/L的萊克多巴胺標準品溶液于50ml離心管中，按照規定步驟操作，經LC-MS/MS分析，得到標準曲線，如圖2所示。試驗表明萊克多巴胺在0.5~20.0μg/L的范圍內具有良好的線性關系，當以萊克多巴胺的峰面積比對其質量濃度進行線性回歸，得到萊克多巴胺線性方程為A=1301.4C+0.03，相關指數R2=0.998916。

圖2 萊克多巴胺LC-MS/MS標準曲線

2.2 檢測限

2.2.1 膠體金試紙卡法 膠體金試紙卡的檢測限是通過對添加了多個水平濃度的萊克多巴胺標準品的樣品檢測而確定的。對添加濃度為1.0、5.0和10.0μg/kg的50份豬肉樣品和50份豬肝樣品的測定結果見表2。由于膠體金試紙卡對豬肉和豬肝樣品在萊克多巴胺的添加濃度為1.0μg/kg時的檢測結果均為陰性，在添加濃度等于或高于5.0μg/kg時的檢測結果均為陽性，可判斷膠體金試紙卡對豬肉和豬肝樣品的檢測限為5.0μg/kg。

表2 萊克多巴胺膠體金試紙卡檢測限判定結果(n=3) (μg/kg)

2.2.2 LC-MS/MS法 在空白豬肉和豬肝樣品中添加0.1、0.25、0.5、1.0μg/kg質量濃度的萊克多巴胺標準品，進行3次平行測定，最低檢測限按照信噪比為3:1計算，得到該方法檢測限為0.25μg/kg。

2.3 實際樣品檢測結果的比較

分別抽取30份豬肉樣品和30份豬肝樣品，采用膠體金試紙卡與LC-MS/MS檢測方法進行對比檢測，結果如表3所示。檢測結果表示：LC-MS/MS法測定陰性結果用“ND”表示，陽性結果以實際檢測結果表示。以5μg/kg檢測限為豬肉和豬肝樣品的陽性判定線，即萊克多巴胺在樣品中的含量低于5μg/kg判定為陰性，含量高于5μg/kg樣品判定為陽性。

通過表3可知，利用膠體金試紙卡和LC-MS/MS法共檢測出1份陽性豬肉樣品和1份陽性豬肝樣品，圖3為膠體金試紙卡測定的樣品結果判斷，其中圖3-a和3-b中的檢測線(T)和質控線(C)同時出現紅色條帶，表示膠體金試紙卡對該豬肉樣品和豬肝樣品的檢測結果均為陰性；圖3-c和3-b中的質控線(C)出現紅色條帶，而檢測線(T)的紅色條帶均消失，表示膠體金試紙卡對該豬肉樣品和豬肝樣品的檢測結果均為陽性。圖4~7為陽性樣品的LC-MS/MS測定的質量色譜圖。圖4表示采用LC-MS/MS法檢測陰性豬肉樣品中萊克多巴胺含量的質量色譜圖；圖5表示采用LC-MS/MS法檢測陰性豬肝樣品中萊克多巴胺含量的質量色譜圖；圖6表示采用LC-MS/MS法檢測豬肉樣品中的萊克多巴胺含量為14.2μg/kg；圖7表示采用LC-MS/MS法檢測豬肝樣品中的萊克多巴胺含量為8.2μg/kg兩種方法測定的陽性樣品和陰性樣品的檢測結果基本一致，可得出膠體金試紙卡的假陽性率為0，假陰性率為0，該方法適用于動物組織中萊克多巴胺殘留量的測定。

表3 膠體金試紙卡和LC-MS/MS對豬肉和豬肝樣品的檢測結果的比較(μg/kg)

圖3 膠體金試紙卡測定的豬肉、豬肝樣品結果判斷圖

圖4 陰性豬肉樣品中萊克多巴胺含量的質量色譜圖

圖5 陰性豬肝樣品中萊克多巴胺含量的質量色譜圖

圖6 22#豬肉樣品中萊克多巴胺含量的質量色譜圖

圖7 18#豬肝樣品中萊克多巴胺含量的質量色譜圖

3 結論

本試驗采用膠體金試紙卡和LC-MS/MS法對動物組織中的萊克多巴胺殘留量進行檢測，對豬肉和豬肝樣品進行1.0、5.0和10.0μg/kg濃度的添加，得到膠體金試紙卡法的檢測限為5μg/kg，對豬肉和豬肝樣品進行0.1、0.25、0.5、1.0μg/kg濃度的添加，得到LC-MS/MS法檢測限為0.25μg/kg；通過對實際樣品的檢測，兩種方法測定結果基本一致，和LC-MS/MS法進行復核驗證，得到膠體金試紙卡的假陽性率為0，假陰性率為0。

LC-MS/MS法檢測靈敏度高，準確度高，但樣品的前處理方法復雜，儀器操作時間比較長，設備昂貴，檢測成本高；利用膠體金試紙卡法檢測，特異性較高，不需要復雜的樣品處理及大型的配套儀器，檢測時間短，檢測結果直觀，檢測成本低，但由于試紙卡的靈敏度會受到一定的限制，所以該方法特別適合在現場大規模樣品抽查中使用，用于定性初篩。LC-MS/MS靈敏度高，適合于陽性樣品的確證和精確定量。

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（2011–11–08）

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