葡聚糖酶在甘蔗混合汁澄清中的應用

賀 湘，趙振剛，*，于淑娟，平野淳也

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；2.阿瑪諾天野酶制劑商貿（上海）有限公司，上海200040）

葡聚糖酶在甘蔗混合汁澄清中的應用

賀 湘1，趙振剛1，*，于淑娟1，平野淳也2

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；2.阿瑪諾天野酶制劑商貿（上海）有限公司，上海200040）

制糖工業中葡聚糖給生產帶來嚴重危害。利用葡聚糖酶降解甘蔗糖廠混合汁中的葡聚糖。首先監測混合汁在自然靜置下葡聚糖含量、過濾速度等指標的變化。其次在不同條件（酶劑量、pH、溫度及酶解時間）下對葡聚糖酶的降解作用進行研究，得到此葡聚糖酶的最佳降解范圍為：酶劑量10~15mg/kg，酶解pH5.0~6.0，酶解溫度50~65℃，酶解時間10~15min。在酶解的最佳范圍內模擬糖廠實際生產流程進行實驗驗證，加入10mg/kg葡聚糖酶，清汁中葡聚糖含量降低了61.32%，沉降時間減少了13.46%，簡純度提高了0.65%，而pH、錘度無明顯變化。

葡聚糖酶，混合汁，葡聚糖，過濾速度

葡聚糖是以葡萄糖為組成單元的一種多糖，廣泛分布于微生物、植物、動物界。制糖工業中的葡聚糖是由腸膜明串珠菌、鏈球菌等屬的微生物分泌葡聚糖蔗糖酶催化蔗糖生成葡萄糖而聚合形成[1]，其分子式為（C6H10O5）n，分子量從一萬到數百萬不等，糖苷鍵的類型主要是α-（1→6），但同時也有少量的α-（1→4）、α-（1→3）和α-（1→2）糖苷鍵[2]。葡聚糖的存在給制糖生產帶來嚴重的影響：造成糖分損失[3]，增大糖液粘度[4]，糖度測定值虛高[5]，降低過濾性，結晶不正常[6]，此外，葡聚糖含量過高的糖產品適用性受到限制：飲料產生絮狀物而渾濁，使糖果、巧克力成型困難等[6]。據文獻報道[7]，以相對分子量40000為標準，蔗糖的損失大約是生產葡聚糖的1.9倍，因而葡聚糖存在而導致的蔗糖直接損失大約為每10000t甘蔗損失7t蔗糖，而間接損失更是直接糖分損失的3～5倍。國內外不少專家學者采取過各種措施來減少或消除葡聚糖，如物理法有澄清法[7]、超聲降解葡聚糖法[8]、膜過濾法（如超濾法、透析分離法和反滲透法）等，化學法[9]主要是加入殺菌劑，如漂白粉、氯水等有機和無機化學殺菌劑，以及青霉素、鏈霉素等抗生素，以抑制微生物的生長或殺滅微生物，生物法主要指酶水解葡聚糖法[10-11]。對已經生成的葡聚糖，目前最有效的方法是加入葡聚糖酶，將葡聚糖降解成小分子糖類[12]。國外已經在很多兩步法糖廠的實際生產經驗中得到了驗證[13-15]，而國內雖對其也有過研究，但多數只停留在葡聚糖的檢測方法方面，對葡聚糖酶在糖廠的應用還鮮有詳細報道。由于地域性及制糖生產方法不同，對葡聚糖酶在國內糖廠的應用研究是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗混合汁（錘度（Brix）14.52，pH5.38，簡純度79.45） 甘蔗糖廠壓榨車間混合汁箱，廣東省湛江市徐聞縣華豐糖廠提供；葡聚糖酶（酶活30000u/mL）、淀粉酶（15000u/g） 日本阿瑪諾天野酶制劑（上海）有限公司；標準蔗糖、標準葡聚糖（葡聚糖T-2000） Sigma公司；無水酒精（DAA）、三氯乙酸（TCA）、堿式醋酸鉛、硅藻土、鹽酸、氫氧化鈉 均為分析純。

Seven Easy pH計，PL403電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；WZZ-2S數字式自動旋光儀，自動阿貝折射儀 上海精密科學儀器有限公司；HH.511-Z電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械廠。

1.2 檢測方法

1.2.1 葡聚糖標準曲線的測定 根據GB 15108-2006原糖中葡聚糖的測定標準加以改進，葡聚糖濃度用mg/kg（對溶液）來表示，且濃度提高到10000mg/kg。測得吸光度A720（y）與葡聚糖濃度（x）的線性關系為：y=0.00027x-0.04337，R2=0.99860。

1.2.2 混合汁葡聚糖測定 根據GB 15108-2006原糖中葡聚糖的測定標準加以改進，以適應液態糖汁的測定：25mL混合汁中加入一定量的葡聚糖酶，在一定條件下反應一定時間后，沸水浴3min滅酶，冷卻至室溫。再加入0.1mL淀粉酶，于（55±2）℃的搖床中反應15min，冷卻至室溫，加入3mL 100g/L的TCA溶液搖勻，加入約2~3g酸洗硅藻土混勻，用布氏漏斗抽濾（開始時用5mL溶液沖洗燒杯），阿貝折射儀測定濾液錘度。分別移取5mL濾液至兩個10mL離心管，其中一個加5mL蒸餾水，混勻，作為空白對照樣，另一個加5mL DAA，搖勻，啟動秒表。（20±0.17）min后用分光光度計在720nm下測定吸光值，實驗樣品的吸光值與空白對照樣的吸光值的差為A′720。

為減少非葡聚糖的多糖引入的誤差，增加以下步驟：混合汁25mL中加入足夠量的葡聚糖酶，以能使葡聚糖完全分解為準（通過實驗后取0.1mL未稀釋的葡聚糖酶，折算后為4000mg/kg蔗汁），按上述方法在同條件下反應同樣時間，測定空白對照樣和實驗樣品的吸光值，二者之差為A″720。則A720＝1.12（A′720-A″720）即為混合汁中葡聚糖濃度所對應的吸光值。系數1.12=（25+3）/25，以更正TCA溶液加入后的蔗汁濃度變化。

為消除實驗過程引起的樣品錘度變化，葡聚糖濃度單位表示為mg/kg·Brix。根據標準曲線，得到：

1.2.3 過濾速度與沉降時間測定 取混合汁約200mL，加入一定量葡聚糖酶在一定條件下反應一定時間，立即用玻璃漏斗過濾（每次過濾用同一個漏斗以減少儀器誤差），濾液為10mL所需要的時間為過濾時間t。過濾速度=10/t。為消除pH、溫度等條件變化帶來的影響，用絕對過濾速度，即添加葡聚糖酶的樣品的過濾速度與對照組樣品的過濾速度之差來表示。

沉降時間：見《制糖工藝分析》教材[16]中的228~ 229頁，指沉降100mL清汁所用的時間。用于實際生產時對過濾速度的表征，沉降時間越短，過濾速度越快。

1.2.4 錘度測定 自動阿貝折射儀測定。

1.2.5 簡純度測定 采用一次旋光法[16]測定糖度，簡純度=糖度/錘度。

1.2.6 自然磷酸值測定 見《制糖工藝分析》教材[16]中219~222頁的方法。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理 混合汁經100目篩過濾，除去懸浮雜質，部分放置于自然環境下約20h，備用。

1.3.2 混合汁在自然環境下各指標的變化 取新鮮混合汁，預處理后測定葡聚糖含量、過濾速度、簡純度、錘度、pH，靜置于自然條件下（室溫15～25℃），隔幾個小時跟蹤測定以上指標，觀察混合汁在自然環境下各指標的變化。

測葡聚糖與過濾速度過程中，另取兩組混合汁，一組加10mg/kg葡聚糖酶，另一組不加酶，在60℃下反應10min，測定葡聚糖含量及過濾速度。

1.3.3 不同條件下葡聚糖酶的降解作用

1.3.3.1 酶劑量對葡聚糖酶降解作用的影響 取預處理后混合汁300mL，測定初始葡聚糖含量、過濾速度、錘度、簡純度、pH，再用NaOH/HCl溶液調節pH為5.5±0.1，裝入6個50mL容量瓶，分別加入0、5、10、15、20、40mg/kg葡聚糖酶，置于（55±2）℃的搖床中反應10min，立即取出煮沸3min滅酶。冷卻至室溫后測定以上各指標。

1.3.3.2 pH對葡聚糖酶降解作用的影響 取預處理后混合汁350mL，分裝入7個50mL容量瓶中，用NaOH/ HCl溶液調節pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0，各加入10mg/kg葡聚糖酶，其他操作與測定指標同1.3.3.1。

1.3.3.3 溫度對葡聚糖酶降解作用的影響 取預處理后混合汁400mL，用NaOH/HCl溶液調節pH為5.0± 0.1，分裝入8個50mL容量瓶，各加入10mg/kg葡聚糖酶，置于溫度為30±2、40±2、50±2、55±2、60±2、65±2、70±2、80±2℃的搖床中反應。其他操作與測定指標同1.3.3.1。

1.3.3.4 酶解時間對葡聚糖酶降解作用的影響 取預處理后混合汁300mL，用NaOH/HCl溶液調節pH為5.5±0.1，裝入6個50mL容量瓶，各加入10mg/kg葡聚糖酶，置于（55±2）℃的搖床中反應，反應時間分別為0、5、10、15、20、30min。其他操作與測定指標同1.3.3.1。

1.3.4 糖廠加葡聚糖酶地點選擇與模擬糖廠實際生產過程實驗

1.3.4.1 糖廠加葡聚糖酶地點選擇 選擇依據：a.根據前面的實驗結果得到的葡聚糖酶最佳酶解反應條件。b.糖廠實際工藝過程：

甘蔗經5級壓榨（第四座壓榨機處加入60～65℃的滲浸水，蔗汁當時溫度可達30～40℃）→混汁緩沖箱→混合汁箱，在此預灰并加磷酸（預灰pH6.5～6.9）→一次加熱（溫度60～65℃）→硫熏中和（中和pH6.9～7.1）→進入中和汁箱→二次加熱（溫度100℃左右，將使葡聚糖酶失活）因此糖廠應用葡聚糖酶的酶解時間定義為：從酶加入點到蔗汁二次加熱所需要的時間。

1.3.4.2 模擬糖廠實際生產過程驗證實驗 根據前面的實驗結果，在選擇葡聚糖酶的加入地點后，模擬糖廠實際生產流程進行驗證實驗。

2 結果與分析

2.1 混合汁在自然環境下各指標的變化情況

圖1 混合汁自然靜置下各指標的變化趨勢Fig.1 Variation tendency of indexes that mixture rests in natural environment

從圖1可以看出，混合汁靜置于實驗室條件下，時間越長，不管是否加熱，其葡聚糖均含量明顯增加，過濾速度、簡純度、pH明顯減小，而錘度變化不大。24h后，葡聚糖含量達793mg/kg·Brix，不加熱樣品的過濾速度僅0.053mL/min，簡純度降低至66，pH僅為4.2。40h后，葡聚糖含量高達1106mg/kg·Brix，而不加熱樣品已幾乎無法過濾，簡純度低至50.02，pH僅為3.56；從圖1B還得到，混合汁經60℃加熱，同時間下過濾速度能得到一定改善，但對其他指標影響并不大，表明糖廠生產過程中一次加熱（60～65℃）能改善蔗汁過濾速度。

分析此現象的原因主要有[17]：a.混合汁本身發生的系列化學變化；b.微生物污染。而后者是最關鍵的原因，也直接影響了前者，加速蔗汁化學反應速率。從田間砍回的甘蔗攜帶了土壤中大量的微生物如腸膜明串珠菌、鏈球菌等。這些微生物隨壓榨進入蔗汁，并利用蔗汁中的蔗糖等營養物質大量繁殖，產生各種有機酸和高粘度多糖。這不僅消耗了蔗糖引起糖分損失，還引起蔗汁pH和純度的降低。此外，產生的高粘度多糖（以葡聚糖為主）也為生產帶來極大的困難，導致生產時間延長，進一步引起更多的糖分轉化，從而出現連帶惡性循環，最終導致產糖率的降低。

2.2 不同條件下葡聚糖酶的降解作用

2.2.1 酶劑量對葡聚糖酶降解作用的影響 從圖2中可知，隨著葡聚糖酶的加入量增加，混合汁中葡聚糖含量逐漸減少，過濾速度逐漸增大，簡純度略微增大，而蔗汁錘度和pH變化不明顯。不加葡聚糖酶的混合汁，其葡聚糖含量高達737mg/kg·Brix，過濾速度僅0.67mL/min；簡純度為65.85，而添加10mg/kg葡聚糖酶的蔗汁，其葡聚糖含量僅260mg/kg·Brix，去除率達64.72%，過濾速度增加到1.63mL/min，簡純度為65.89；到40mg/kg時葡聚糖含量減小到203mg/kg·Brix，過濾速度達到2.18mL/min，簡純度增至66.04。然而，從10mg/kg到40mg/kg，三者的變化趨勢卻逐漸變緩。

圖2 不同糖酶劑量下混合汁各指標的變化Fig.2 Variation tendency of mixture indexes at different enzyme dosages

理論上，保持反應體系中其他成分不變，隨著酶濃度增加，酶與底物接觸機會也增加，同一時間內更多的大分子的葡聚糖被水解成小分子低聚糖，而小分子低聚糖粘度小，混合汁過濾速度增大，且混合汁經堿式醋酸鉛澄清后更透明，測得的純度也有所增大。當酶濃度增加至一定程度，酶分子逐漸被飽和，水解速度變緩慢。蔗汁錘度、pH無明顯變化，其原因是蔗汁酶解時間較短，僅為10min，故添加葡聚糖酶對其幾乎無影響，在后續實驗中也不再測定錘度和pH的變化。由于酶制劑價格昂貴，綜合經濟上考慮，添加10~15mg/kg葡聚糖酶較為合適。

2.2.2 pH對葡聚糖酶降解作用的影響 從圖3-A可以看出，隨著pH升高，葡聚糖去除率先增大后減小，當在pH4.0~6.0時葡聚糖酶對葡聚糖的去除率較理想，最高可達60%左右。圖3-B可知，添加10mg/kg葡聚糖酶的混合汁的過濾速度在不同pH均大于不加酶混合汁的過濾速度，表明葡聚糖酶的確改善混合汁的過濾性能。隨著pH增大過濾速度逐漸減小，但在pH為7.0處略微增大，其可能原因是：蔗汁本是種膠體溶液，pH增大后，膠體的穩定性增加，過濾速度下降，而在pH為7.0時，正負離子中和，各金屬離子容易沉淀，使過濾速度反而有一定增大。在測定范圍內，絕對過濾速度先增大后減小。在pH5.0～6.0時絕對過濾速度較大，為1.71~2.89mL/min，表明葡聚糖酶在此范圍內具有較大的酶解性能。而在堿性范圍內，絕對過濾速度很小，葡聚糖酶的酶解作用并不明顯。圖3-C中，簡純度也在pH5.0～6.0處較高。

酶的生物學特征之一是它對酸堿的敏感性，這表現在酶的活性和穩定性易受環境pH的影響。pH通過改變酶的肽鏈構象、氨基酸殘基微環境而對酶的活性的影響極為顯著[18]。同一種酶在不同的pH下所表現的活性不同，其表現活性最高時的pH稱為酶的最適pH，過酸或過堿都會影響酶活性的發揮。另外，甘蔗混合汁的pH一般在5.0~6.0之間，故綜合分析，葡聚糖酶降解作用的最佳pH范圍為5.0~6.0。

2.2.3 溫度對葡聚糖酶降解作用的影響 從圖4可知，酶解溫度對混合汁中葡聚糖含量及過濾速度影響都很大。從圖4-A來看，相比不加酶的對照樣，加10mg/kg葡聚糖酶的混合汁，葡聚糖都有不同程度的去除，說明葡聚糖酶對溫度的穩定性較好，在此范圍內均具有一定的酶解性能；而隨著溫度升高，葡聚糖去除率先增大后減小，在50~60℃時葡聚糖的去除率最高，達62.9%。從圖4-B來看，加10mg/kg葡聚糖酶的混合汁與不加酶的混合汁，其過濾速度均隨著溫度的升高而升高，且在任一溫度下，加酶的混合汁過濾速度比不加酶的要大，說明葡聚糖酶在此溫度范圍內均可以改善混合汁的過濾性能。而絕對過濾速度先增大后減小，在50~65℃較大，為1.52~1.78mL/min。圖4-C中簡純度也在50~65℃較高。

溫度對酶活性也有很大的影響[19]：低溫時由于酶蛋白活化分子數目少，反應速度低，溫度升高，酶蛋白活化分子數增加，酶促反應加快，但當溫度增加達到某一點后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應速度迅速下降。酶促反應速度隨溫度升高而達到最大值時的溫度就稱為酶的最適溫度。綜合比較，選取葡聚糖酶降解作用的最佳溫度為50~65℃。

圖4 不同溫度下混合汁加酶后各指標的變化Fig.4 Variation tendency of mixture indexes at different temperature

2.2.4 酶解時間對葡聚糖酶降解作用的影響 從圖5可以看出，隨著時間延長，混合汁中葡聚糖含量逐漸減少，過濾速度逐漸增加，簡純度逐略微減少。0min時葡聚糖含量為740mg/kg·Brix，過濾速度僅為0.67mL/min，簡純度為65.83，而酶解15min后其葡聚糖含量減少到233mg/kg·Brix，過濾速度增加到3.58mL/min，簡純度減至65.78；30min后各指標分別為203mg/kg·Brix、5.56mL/min和65.76。

圖5 不同酶解時間混合汁加酶后各指標的變化Fig.5 Variation tendency of mixture indexes at different reaction time

在制糖生產過程中，生產時間越長，微生物影響越大，蔗糖轉化也越多，造成產糖率越低，因此，在保證生產正常的前提下，應盡可能縮短生產時間。根據糖廠實際生產流程，從混合汁到二次加熱（100℃左右）的時間在10~12min，有的甚至小于10min。極少數國外糖廠能超過12min，最長為20~25min[3]。故從國內實際情況考慮，酶解時間為10~12min比較合理，若加一緩沖箱，最多達15min。

2.3 糖廠葡聚糖酶加入地點選擇與模擬糖廠實際生產過程實驗

2.3.1 葡聚糖酶加入地點選擇 由于生產具有波動性，且每個糖廠因甘蔗成分、甘蔗放置時間、周圍環境等也具有不確定性，因此在應用葡聚糖酶處理甘蔗混合汁時，其最佳酶解條件也應具有一定的參考范圍，此范圍由上述實驗即可得出：葡聚糖酶的最佳酶劑量為10~15mg/kg，酶解溫度為50~65℃，酶解pH為5.0~6.0，酶解時間為10~15min。

根據糖廠實際生產工藝流程，在甘蔗糖廠，葡聚糖酶可選擇加入的地點依次有：

a.滲浸水加入處：此處滲浸水溫度為60~65℃，蔗汁溫度為35~40℃，酶解時間為10~15min，蔗汁pH為5.0~5.8。

b.混合汁箱（預灰前）：此處蔗汁溫度為25~35℃，酶解時間為8~10min，pH為5.0~5.8。

c.混合汁箱（預灰后）：此處蔗汁溫度為25~30℃，酶解時間為6~8min，pH為6.5~6.9。

d.一次加熱后硫熏中和前：此處蔗汁溫度為60~ 65℃，酶解時間為3~5min，pH為6.5~6.9。

e.中和汁箱（中和后）：此處蔗汁溫度為55~65℃，酶解時間＜3min，pH為6.9~7.1。

綜合葡聚糖酶的最佳酶解條件與糖廠實際工藝過程，擬選擇滲浸水加入處為葡聚糖酶的最佳加入點，酶加入量為10~15mg/kg，酶解時間為10~12min，此時蔗汁pH為5.0~5.8，蔗汁溫度為35～40℃。在蔗汁二次加熱前，基本能在葡聚糖酶的最適范圍內，且蔗汁經過一次加熱流程時溫度能達到最適溫度，既不使酶失活，也能最大限度地發揮葡聚糖酶的酶解性能。

2.3.2 模擬糖廠實際生產過程的驗證實驗 選定好葡聚糖酶加入點后，通過添加10mg/kg葡聚糖酶模擬糖廠實際生產流程進行驗證實驗。其具體流程為：

混合汁經100目篩過濾，測定其葡聚糖含量、沉降時間、純度、錘度、pH、自然磷酸值→加熱至35～40℃→加葡聚糖酶10mg/kg，混合均勻→加適當磷酸，使混合汁的磷酸值為400mg/kg→加消和后的石灰乳使pH達到6.5±0.2→一次加熱（加熱溫度為65℃）→硫熏（硫熏強度為22mL）→中和（pH為7.0±0.1）→二次加熱（加熱溫度為100℃）→加絮凝劑2mg/kg→過濾→迅速測沉降時間、葡聚糖含量、純度、錘度、pH。

表1 模擬糖廠實驗加酶與不加酶各指標的比較Table 1 Contrast on mixture indexes whether adding dextranase by simulating the practical of sugar production process

模擬糖廠實際生產流程進行驗證實驗，結果如表1。在預灰加磷酸前，加入10mg/kg葡聚糖酶，經一系列流程后，葡聚糖含量減少了61.32%，沉降時間減少了13.30%，簡純度提高了0.65%，pH、錘度無明顯變化。

3 結論

3.1 混合汁靜置于自然條件下，時間越長，其葡聚糖含量明顯增加，過濾速度、簡純度、pH明顯減小，錘度變化不大。說明蔗汁靜置在自然條件下，時間越長，蔗汁受微生物污染越嚴重。

3.2 通過在不同條件（酶劑量、pH、溫度及酶解時間）對葡聚糖酶的降解作用研究，并結合糖廠實際生產條件，得到葡聚糖酶適合制糖生產的最佳酶解范圍為：酶劑量10~15mg/kg、酶解pH5.0~6.0、酶解溫度50~ 65℃、酶解時間10~15min。

3.3 綜合葡聚糖酶的最佳酶解條件與糖廠實際工藝過程，選擇滲浸水加入處為葡聚糖酶最佳加入點。在最佳酶解范圍內，模擬糖廠實際生產流程進行驗證。加入10mg/kg葡聚糖酶，經一系列工藝過程后，得到的清汁葡聚糖含量降低了61.32%，沉降時間減少了13.30%，簡純度提高了0.65%，pH、錘度無明顯變化。

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Application of dextranase in sugarcane mixed juice clarification

HE Xiang1，ZHAO Zhen-gang1，*，YU Shu-juan1，Hirano Atsuya2
（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Amano Enzyme China Ltd.，Shanghai 200040，China）

The formation of dextran has caused serious problems in sugar processing.Dextranase was applied to breakdown dextran.Firstly，the content of dextran and filtration rate of sugarcane mixed juice，which was exposed to the natural environment were determined.Then single factor experiments were conducted，with enzyme dosage，pH，temperature and reaction time to be factors.The reference results were：enzyme dosage 10～15mg/kg，pH5.0～6.0，temperature 50～65℃，and reaction time 10～15min.Finally，in the optimal condition，a confirmatory experiment was conducted by simulating practical of sugar processing：adding 10mg/kg dextranase，dextran in clarified juice was removed 61.32%，settling time was cut down 13.46%，purity was raised 0.65%，pH and Brix had no obvious changes.

dextranase；mixed juice；dextran；rate of filtration

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）09-0175-06

2011－06－27 *通訊聯系人

賀湘（1986-），女，在讀碩士研究生，研究方向：糖品工程與糖類衍生物。

阿瑪諾天野酶制劑商貿有限公司委托項目（20100913110751）；中央高校面上項目（2011ZM0105）。