直投式發酵劑制備的哈爾濱風干腸在成熟過程中的理化及微生物特性變化

孔保華，夏 讓，夏秀芳，刁新平

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030; 2.東北農業大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱150030)

直投式發酵劑制備的哈爾濱風干腸在成熟過程中的理化及微生物特性變化

孔保華1，夏 讓1，夏秀芳1，刁新平2

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030; 2.東北農業大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱150030)

采用三種由自然發酵分離鑒定出的微生物，按一定比例混合制備復合發酵劑，將其用于哈爾濱風干腸中，研究其對風干腸的理化性質、微生物變化和游離氨基酸含量的影響。實驗分為三組，分別為對照組，添加普通發酵劑組和添加直投式發酵劑組。結果表明:添加發酵劑的風干腸pH明顯低于對照組，且添加直投式發酵劑的pH最低(P＜0.05);添加發酵劑會使產品的游離氨基酸含量顯著提高(P＜0.05)、感官品質也較好(P＜0.05)，而各組水分活度變化差異不明顯，這說明直投式發酵劑具有很好的活力和發酵性能，能夠顯著提高風干腸的質量，縮短發酵時間。

發酵風干腸，微生物，理化特性，發酵劑

乳酸菌發酵生產的發酵香腸是一類發展前景廣闊的肉制品。中式發酵香腸便是其中一種重要的傳統發酵肉制品［1］。將乳酸菌發酵劑添加在風干腸中可改善產品品質、縮短產品生產周期［2］。乳酸菌是肉制品中常用的發酵劑，近幾年也有很多關于酵母菌和葡萄球菌做發酵劑的報道［3－4］。乳酸菌和酵母混合發酵能使產品形成很好的風味，并使色澤穩定;也有利用葡萄球菌和酵母菌復合做發酵劑的報道［5］。發酵劑混合使用，更能使發酵香腸的優勢得到充分體現。利用從肉制品中分離出來的乳酸菌生產發酵肉制品，產品的質量得到改善，產品的風味和色澤也發生變化，能夠延長產品保藏期，抑制有害菌的增殖，防止腸毒素的產生，這一方式在歐美國家中已被廣泛使用［6］。Erkkil?等將乳酸菌接種于發酵腸中，乳酸菌很容易大量繁殖成為優勢菌群［7］，制得的發酵肉制品pH相對較低，但不太適應中國人的口味。本實驗利用從自然發酵哈爾濱風干腸中分離純化出的一株乳桿菌L5、一株葡萄球菌S2和一株酵母菌Y4，通過添加凍干保護劑、凍干濃縮制備直投式復合發酵劑。利用乳酸菌發酵可以使產品產生獨特的風味、顏色和質地［8］。乳桿菌 L5可快速降低產品的pH，起到調節制品pH的作用，長期寄居在人體內，還能調節腸道菌群［9］。葡萄球菌S2能促進肌肉蛋白質降解為氨基酸，對產品風味的形成有一定的促進作用［10］。在腸表面接種酵母菌，可使產品表面產生一種白色物質［11］，產生酵母味。本實驗將直投式復合發酵劑應用于風干腸中，探討制品在發酵干燥過程中pH、水分含量、Aw和游離氨基酸的變化，以研究復合式直投式發酵劑對風干腸綜合品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

從自然發酵的風干腸中分離鑒定的三種菌，包括一株乳桿菌L5、一株葡萄球菌S2和一株酵母菌Y4 以上菌種保藏于東北農業大學畜產品加工實驗室，是本實驗室從發酵肉制品中提取并分離，經過鑒定，在本實驗中使用;MRS(Man Rogosa and Sharp)培養基 參照GB4789.2－2003，用于活化培養乳酸菌; MSA(Manntilo Salt Agar)培養基 參照GB4789.2－2003，用于葡萄球菌的活化、傳代及制備發酵劑;麥芽汁培養基(Malt Extract Agar，MA) 用于活化培養酵母菌及制備發酵劑;健康新鮮的瘦肉(豬臀肉)、肥肉(背膘脂肪)、麯酒(玉泉大麯)、糖、姜、淀粉、味素、鹽、桂皮、花椒、大料、丁香等及豬小腸衣 均為市售。

SYQ－DSX－280B高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫用儀器廠;AL104精密電子天平、DELTA 320pH計上海梅特勒－托利多儀器有限公司;ZE6000色差計日本色電工業株式會社;DHP－9272電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;智能水分活度儀Decagon Devices公司;ZHJH－1109超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;HBM－400B樣品均質器 天津市恒奧科技發展有限公司;GL－21M冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;SPX－250B－D搖床培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵劑的制備 將各菌種分別在各自的培養基活化并擴大培養。乳桿菌培養條件:37℃，17h;葡萄球菌培養條件:32℃，17h;酵母菌培養條件: 37℃，15h。

根據本實驗室前期的實驗結果，綜合考慮各種菌種的發酵特性，配制復合發酵劑［12］。該發酵劑由從傳統發酵風干腸中分離得到的一株乳桿菌L5、一株葡萄球菌S2和一株酵母菌Y4組成。其中一個實驗組為將以上菌種離心制得菌泥投入到腸中，另一個實驗組為將以上菌種離心得到的菌泥添加凍干保護劑，經過真空凍干制得菌粉添加到腸中。

1.2.2 發酵風干腸的制備

1.2.2.1 配料 瘦肉(豬臀肉)90kg，肥肉(豬背脂) 10kg，麯酒(玉泉大麯，)500mL，糖0.5kg，姜0.5kg，淀粉0.5kg，味素0.15kg，鹽2.0kg，混合調料0.2kg(混合調料包括桂皮，花椒，大料，丁香等)。

1.2.2.2 發酵風干腸生產的工藝流程 新鮮原料肉(剔除淋巴，筋腱，血管等結締組織)→絞肉(瘦肉切塊，肥肉切丁)→腌制(加鹽和亞硝)→加調味料(發酵風干腸加發酵劑)→拌餡→灌制→發酵(30℃，3d)→風干→捆把→蒸煮15min→成品。

1.2.2.3 樣品的處理 選擇3組樣品處理，一組為自然發酵風干腸的對照組，一組為添加普通發酵劑(添加液體菌種)的實驗組，一組為添加直投式發酵劑(添加菌粉)的實驗組，使得兩組添加菌種的實驗組每克肉中分別含有乳桿菌L5的數量約為106cfu/g、葡萄球菌S2和酵母菌Y4的數量約為107cfu/g，將菌種按上述添加量添加到肉中，充分混勻。將接種菌種的風干腸在30℃發酵72h。對照組不添加任何發酵劑只添加配料，置于30℃發酵72h。分別在0、24、48、72h進行各種指標的的測定。

1.2.3 pH的測定 GB/T 9695.5－2008，剝去腸衣，取腸體中心的肉樣10g，添加90mL預冷的蒸餾水，使用樣品勻質器勻漿，使用pH計測定。

1.2.4 水分含量的測定 采用直接烘干法。

1.2.5 水分活度(Aw)的測定 將樣品在室溫下切碎，鋪滿樣品盒的底部，使用水分活度儀測定。

1.2.6 色差的測定 將待測樣品用絞肉機絞碎后，用 ZE6000色差計測定。白板 X為 90.18，Y為95.08，Z為103.29。采用D65光源，2°視角，30mm聚光鏡測定。重復三次，取平均值。

1.2.7 感官評定 由本實驗室研究生組成7人感官評定小組。在進行評定前要對評定小組進行培訓，統一評定標準。將待檢樣品煮制15min，隨機編號放入托盤中，進行評價。評定指標包括風味、酸敗味、酸味、回味(品嘗以后口腔殘存的味道)［13］、咀嚼性、顏色、嫩度和總體可接受性。對于風味，7分為具有發酵風干腸特有的風味，1分風味較差;對于酸敗味，1分為酸敗味不可察覺，7分為酸敗味濃重;對于酸味，7分為發酵肉制品適度的酸味，1分為幾乎沒有酸味或過酸;對于回味，7分為有較強回味，1分為幾乎沒有回味;對于咀嚼性，7分為風干腸具有適當的肉類咀嚼性，1分為咀嚼性較差;對于顏色，7分為風干腸正常的發紅顏色，1分為顏色較差，出現異色;對于嫩度，7分為硬度適口，1分為過硬;對于總體可接受性，7分為可接受性高，1分為可接受性低。

1.2.8 菌相的變化 采用稀釋平板計數法［14］。在無菌條件下用無菌生理鹽水將菌液以10倍的倍數依次遞增稀釋至適宜稀釋度，選擇3個合適稀釋度接種于相應固體平板(每個稀釋度做3次平行)，并用無菌涂布棒將其充分涂抹均勻，將乳桿菌L5和酵母菌Y4置于35～37℃，葡萄球菌S2置于32～35℃恒溫培養箱中培養(48±2)h后取出計數菌落數。

1.2.9 游離氨基酸的分析 樣品經脫脂后，干燥研碎，用80%乙醇，超聲波浸提，定容100mL后，用氨基酸自動分析儀分析。按GB/T18246－2000執行，由黑龍江省獸藥飼料監察所完成。

1.2.10 統計分析 所得數據為三次重復實驗的平均值。使用Sigmaplot 9.0作圖，使用Statistix 8.1進行統計分析，并進行多重比較(P＜0.05)。

2 結果與討論

2.1 發酵劑對發酵風干腸pH的影響

由圖1可以看出，添加復合發酵劑的實驗組和對照組的pH均呈現下降趨勢，下降幅度存在很大差異。自然發酵風干腸的pH呈現先小幅上升后緩慢下降的趨勢，這是由于在自然發酵的前期，乳酸菌的生長處于遲緩期，產酸較少，此時蛋白酶在肉中降解產生非蛋白氮［10］，使pH緩慢回升。隨著發酵的進行，乳酸菌大量生長，pH降低。添加發酵劑的實驗組pH持續降低，這是因為添加發酵劑的風干腸在發酵初期，乳酸菌即為優勢菌大量生長，代謝碳水化合物產生乳酸，使pH始終處于下降的狀態，發酵腸的最終pH降至5.4左右對實際生產有利［15］。同時，添加菌粉發酵劑的實驗組比添加液體發酵劑的實驗組pH降低快，這可能是由于菌粉中含有的保護劑有促進菌種生長的因子，在適當的條件下，菌體大量繁殖。

圖1 添加發酵劑對風干腸pH的影響Fig.1 The influence of direct vat starter on pH of Harbin sausage

2.2 發酵劑對發酵風干腸水分含量和水分活度(Aw)的影響

從圖2中可以看出不同處理組的水分含量和水分活度均呈持續下降的趨勢，水分含量隨著發酵時間的延長，降低幅度有所不同，但差異不大，添加發酵劑的各實驗組水分含量低于自然發酵的對照組。這可能與pH的變化有關，隨發酵的進行，乳酸菌代謝碳水化合物產酸，pH下降，添加菌粉發酵劑的實驗組pH接近肌肉蛋白等電點(pI=5.4)，此時蛋白的保水能力較差，結合水轉化為自由水，加快腸體表面水分向外界環境中擴散的速度。

圖2 添加發酵劑對風干腸水分含量和水分活度的影響Fig.2 The influence of direct vat starter on water content and Aw of sausage

發酵肉制品的發酵過程常常伴隨著水分活度的降低。低水分活度也是發酵肉制品貨架期長和食用安全性高的一個因素。從圖2中可以看出，實驗組和對照組的水分活度變化趨勢是一致的，但下降的幅度有所不同。自然發酵的風干腸水分活度下降速度較慢，添加復合菌種發酵劑的實驗組，水分活度下降較快;而添加菌粉發酵劑的實驗組水分活度下降則相對更快，72h時出現明顯差異(P＜0.05)。這與pH的降低有關，pH下降，導致肌肉蛋白保水能力減弱，游離出自由水，加快了風干腸的干燥速度，使水分活度降低，減少微生物能利用的水分，而且在酸性條件下病原菌及腐敗菌的生長受到抑制［16］，有助于實際的生產應用。

2.3 發酵劑對發酵風干腸色差的影響

圖3為添加復合發酵劑實驗組的色差變化曲線圖，由圖3可以看出，添加發酵劑的風干腸和自然發酵風干腸的亮度(L*值)和紅度(a*值)總體上都呈現上升趨勢。添加菌粉發酵劑的風干腸的L*值和a*值都高于其他兩組，主要是由于菌粉中含有益菌因子，促進乳酸菌和葡萄球菌的生長，由于葡萄球菌具有增色作用，所以葡萄球菌大量生長繁殖時，促進發色，使得腸體色澤較好。而在發酵后期，添加菌粉發酵劑的風干腸的L*值和a*值又有下降趨勢，可能是因為在發酵后期，乳酸菌繁殖，積累大量乳酸，pH過低，抑制葡萄球菌的生長，所以使風干腸的顏色受到影響。

圖3 接種發酵劑風干腸L*值和a*值的變化情況Fig.3 The changes of L*values and a*values in fermented sausages with direct vat starter

2.4 發酵劑對于風干腸感官評定的影響

從表1中可以看出添加發酵劑的實驗組各組的感官指標均好于自然發酵組，并且添加直投式發酵劑的實驗組酸味、咀嚼性和總體可接受性要顯著好于(P＜0.05)添加普通發酵劑的實驗組。這可能是由于在發酵過程中，菌粉中的凍干保護劑含有利于菌株增殖的因子，促使菌株快速生長，加快產品風味的形成。乳酸菌發酵糖類產生乳酸，降低產品pH，當pH降低，接近肌肉蛋白的等電點(pI=5.4)時，在酸性條件下肌肉蛋白形成膠狀組織，增加肉塊間的粘著力，提高肉制品的彈性，組織細膩，口感也有所提高。所以經乳酸菌發酵的食品具有獨特的風味［17］。各組產品均不產生任何酸敗味，產品在發酵過程中都以乳酸菌為優勢菌，抑制其他有害菌生長。添加發酵劑的各組均有適當的酸味主要是由于乳酸菌發酵產生乳酸，乳酸大量積累，適當的酸味促進產品風味的形成，過酸則會降低產品品質，使消費者難以接受。乳酸菌對產品顏色和嫩度的影響不大，主要是由于腸體內酸性環境有效地抑制了葡萄球菌的生長。

表1 添加發酵劑生產的風干腸的感官評價Table 1 The sensory evaluation of fermented sausage with direct vat starter

2.5 發酵劑對發酵風干腸菌數的變化

圖4為添加菌粉發酵劑的風干腸及添加菌液發酵劑的風干腸中乳酸菌菌數、葡萄球菌菌數和酵母菌菌數的變化曲線圖。由圖4可以看出，隨著發酵時間的延長，兩個處理組的乳酸菌經歷了一個先增加后減小的過程，添加菌液發酵劑的風干腸中葡萄球菌和酵母菌在0～48h都呈增長趨勢，之后菌數逐漸減少;而添加菌粉的處理組在發酵0～24h時葡萄球菌和酵母菌的菌數是逐漸增加的，隨著發酵的繼續，菌數呈現持續下降狀態。這可能是由于在發酵過程中，添加菌粉發酵劑風干腸中的乳酸菌較菌液發酵劑風干腸的增殖速度快，在短期內大量增殖，產生大量乳酸，很快成為優勢菌抑制葡萄球菌和酵母菌的生長。而添加菌液的處理組在發酵初期，乳酸菌生長相對緩慢，腸體內的酸性環境較弱，葡萄球菌和酵母菌仍能小幅增殖，在發酵至48h積累大量乳酸，抑制葡萄球菌和酵母菌的生長，菌數降低。

圖4 添加發酵劑對風干腸菌數的影響Fig.4 Effect of different fermented sausages on strain number

2.6 風干腸中游離氨基酸的變化分析

由表2中可以看出，添加發酵劑的實驗組游離氨基酸的水平顯著高于對照組。表明發酵劑中的葡萄球菌在發酵過程中迅速繁殖，加速蛋白質的水解，與許多研究的觀點一致［18］。游離氨基酸與滋味直接相關，游離氨基酸通過降解形成風味化合物的前體，對風味的形成有重要作用。

表2 風干腸中游離氨基酸的變化情況(mg/100g)Table 2 The changes of free amino acid in different fermented sausages(mg/100g)

從表2中可以看出，添加菌粉的發酵風干腸中游離氨基酸的含量高于添加菌液的風干腸，更高于自然發酵的風干腸。這可能是由于菌粉發酵劑中含有促生長因子，在適宜的條件下，葡萄球菌就會快速增殖，迅速分解腸體中的蛋白質。谷氨酸是含量最高的氨基酸，谷氨酸是非常重要的鮮味物質，其含量提高有助于改善產品的最終風味。在發酵風干腸中，天門冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸是含量較高的氨基酸，他們的共同作用形成了風干腸的綜合風味。

3 結論

采用直投式發酵劑制成菌粉生產風干腸，其pH在72h內降低至5.2，提高了產品的食用安全性和貯藏性，比自然發酵風干腸具有明顯優勢。添加發酵劑的實驗組和自然發酵的對照組的水分活度變化差異不明顯，但添加發酵劑的風干腸其游離氨基酸含量明顯高于自然發酵組，游離氨基酸含量的增加有利于改善和提高產品風味，添加發酵劑實驗組的產品總體可接受性要優于對照組，同時添加發酵劑的實驗組明顯縮短了發酵周期，賦予產品特有的發酵風味。

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Changes in microbial and physiochemical properties of Harbin traditional drying sausage prepared by direct vat starter during the ripening process

KONG Bao－hua1，XIA Rang1，XIA Xiu－fang1，DIAO Xin－ping2
(1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 2.College of Animal Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The mixture of three microorganism identified from natural fermented Chinese sausage was used to produce Harbin fermented sausage.The changes of microbflora，physico－chemical properties and the contents of free amino acid were analyzed.There were three treatments of sausages，including control group，adding the normal starter group，and adding direct vat starter group.The results showed that compared with those of control group，the value of pH in experimental groups decreased apparently，and the pH(with direct vat starter)was the least(P＜0.05)，the contents of free amino acids in products increased significantly(P＜0.05)adding starters.There was no obvious difference between water activity with experimental groups and control group.Sensory characteristics of experimental group(with direct vat starter)were improved significantly(P＜0.05).It was indicated that the direct vat starter prepared with great vitality and work performance could improve significantly the quality of Harbin traditional sausage and shorten the fermented time.

fermented sausage;microbiology;physiochemical properties;starter culture

TS251.6+5

A

1002－0306(2012)08－0168－05

2011－03－25

孔保華(1963－)，女，教授，博士生導師，研究方向:畜產品加工。

東北農業大學創新專項基金(20090301);國家公益性行業(農業)科研專項經費項目(200903012－02)。