冷脅迫對冷凍干燥羅伊氏乳酸桿菌細胞膜流動性的影響

李寶坤，田豐偉，劉小鳴，趙建新，張 灝，宋元達，陳 衛，*

(1.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122; 2.石河子大學食品學院，新疆石河子832000)

冷脅迫對冷凍干燥羅伊氏乳酸桿菌細胞膜流動性的影響

李寶坤1，2，田豐偉1，劉小鳴1，趙建新1，張 灝1，宋元達1，陳 衛1，*

(1.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122; 2.石河子大學食品學院，新疆石河子832000)

以DPH(1，6－二苯基－1，3，5－己三烯)為熒光探劑，優化了測定羅伊氏乳酸桿菌細胞膜流動性的條件，其最佳測定條件為:激發波長360nm，發射波長430nm，菌濃度OD 0.8，30℃孵育時間為20min。同時研究冷脅迫處理對冷凍干燥存活率。細胞活力及細胞膜流動的影響，研究表明冷脅迫能改善乳酸菌的冷凍干燥存活率，同時在一定的條件下，凍干后細胞的流動性也有所改變，說明經過一定的冷脅迫處理后，增加了細胞的抗性，從而提高細胞的冷凍存活率。

冷脅迫，羅伊氏乳酸桿菌，DPH，細胞膜流動性，冷凍干燥

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri) 本實驗室保存;培養基 MRS;1，6－二苯基－1，3，5－己三烯DPH，Aldrich公司;四氫呋喃、其他試劑 均為分析純。

650－60熒光分光光度計 日本，日立有限公司;冷凍干燥機 美國，LABCONCO有限公司;2450紫外－可見光分光光度計 島津國際貿易(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脅迫處理 菌體培養18h(穩定前期)后，經過離心濃縮，加入15%蔗糖(w/v)作為保護劑，分裝為9份，其中1份立即在－80℃預凍，其余分別放在4℃與10℃進行冷脅迫處理，經過1、2、3、4h處理后，放入－80℃預凍后進行冷凍干燥

1.2.2 凍干存活率計算 將凍干后的菌粉用PBS復水至凍干前相同體積，采用MRS倒平板法，37℃下培養48h，計數。實驗重復3次，每次實驗3個平行。根據NA/NB×100%計算存活率，NA是凍干后細胞數，NB為凍干前細胞數。

1.2.3 細胞膜流動性的測定 采用熒光雙折射法測定細胞膜流動性。用四氫呋喃配制成2mmol/L DPH貯備液，使用前用PBS(pH 7.0)稀釋至2μmol/L備用。取2mL菌懸液(適宜菌濃度)離心后棄上清。加入2mL DPH試劑，混合均勻，在30℃條件下溫浴一段時間，然后，在8000r/min條件下離心去上清，加入2mL PBS混合均勻，進行熒光測定。選擇合適的激發波長，發射波長，選擇適當的狹縫(5mm)和靈敏度，非標記細胞為空白對照。

熒光偏振(P)和細胞的平均微粘度(η)的計算公式如下:

IVV和IVH分別表示:激發光為垂直方向的偏振光，而發射光分別為垂直和水平方向的偏振光時測得的熒光強度;G為光柵矯正因子(G=IVH/IHH)，IHV和IHH是激發光為水平方向的偏振光，而發射光分別為垂直和水平方向的偏振光時測得的熒光強度。P和η越大說明細胞膜流動性越小。

1.2.4 熒光雙折射法測定羅伊氏乳酸桿菌細胞膜流動性條件優化 以360nm為激發波長對DPH溶液，未標記染料的空白菌體溶液和用DPH標記的菌體分別掃描，以確定發射波長。通過不同菌濃度(OD值)標記的樣品的比較確定合適的菌濃度。將同一組標記的菌體用不同的溫浴時間處理，通過實驗確定最佳溫浴時間。

1.2.5 數據處理 細胞膜流動性的數據利用DPS7.05，采用Duncan新復極差法(SSR)多重比較，結果以±s表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 膜流動性條件的優化

2.1.1 DPH標記菌體發射波長的確定 選擇360nm為激發波長，分別掃描了含有2μmol/L DPH溶液、未標記菌體(OD為0.2)及標記菌體的熒光發射光譜，結果見圖1～圖3。

從圖1，圖2可以看出沒有加菌體時的染料和未加染料的菌體最高峰都是414nm，圖3為加了染料標記的菌體，其最高峰移至430nm，說明430nm的波峰是由熒光激發的，而在PBS中2×10－6mol/L的DPH是沒有熒光的，只有菌體也不能激發430nm的熒光波峰。當DPH摻入到細胞膜脂的烴鏈區后，介質粘度變大，順反異構化受到抑制，從而成為唯一能發熒光的全反構型。結合后的DPH，其最大發射峰位在430nm。以360nm為激發波長，確定發射波長為430nm。

圖1 染料DPH熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectrum of DPH

圖2 未標記菌體(OD 0.2)熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectrum of unlabeled LAB

圖3 DPH標記菌體(OD=0.2)熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectrum of labeled LAB

2.1.2 DPH標記菌體菌濃度的確定 在激發波長360nm，發射波長430nm條件下分別測定 OD600為0.1～0.9。

由圖4可以看出，菌濃度在OD小于0.6的情況下，熒光強度隨著菌濃度的上升而增強，當OD大于0.8時，熒光強度趨于穩定，因此，確定最適當的菌濃度為OD 0.8。

2.1.3 孵育時間對熒光強度的影響 在上述條件下，將菌體孵育10、20、30、40min，測定其熒光強度，結果如圖5所示。

由圖5可見，熒光強度在20min后即達平衡，30min后開始下降，這可能是DPH自身淬滅的結果。故選擇樣品在30℃下溫育20min。

通過以上確立了羅伊氏乳酸桿菌細胞膜流動性實驗的條件:激發波長360nm，發射波長430nm，菌濃度為OD 0.8，孵育時間為20min。在此條件下測定羅伊氏乳酸桿菌熒光光譜如圖6所示。

圖4 菌濃度對熒光強度的影響Fig.4 Effect of OD on fluorescence intensity

圖5 孵育時間對熒光強度的影響Fig.5 Effect of time on fluorescence intensity

圖6 最佳條件下DPH標記羅伊氏乳酸桿菌熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectrum of labeled LAB under the optimum conditions

通過圖6可以看出，在最佳條件下，菌體的熒光發射光譜發生了顯著的變化，在430nm處熒光強度高達18.96。

2.2 冷脅迫處理對菌體存活率的影響

菌體按照方法1.2.1處理后進行冷凍干燥，結果見圖7。

圖7 冷脅迫對冷凍干燥乳酸菌存活率的影響Fig.7 Effect of stress on the survival rate of LAB during freeze－drying

通過圖7可以看出經過不同的脅迫處理后，冷凍干燥羅伊氏乳酸桿菌的存活率有一定的差異，其中以4℃、3h最高為91.90%，其次為4℃、2h處理為89.16%，分別比未處理組85.77%提高了6.13%，3.39%。說明經過脅迫處理后可以改善菌體的抗冷凍干燥的能力。

2.3 冷脅迫對菌體活力及細胞膜流動性的影響

在最適實驗條件，測定冷脅迫條件下冷凍干燥后菌種的活力(發酵MRS培養基6h)及細胞膜流動性，實驗數據用 DPS7.05采用Duncan新復極差法(SSR)多重比較，結果以±s表示，P＜0.05為差異顯著，結果如圖8所示。

圖8 冷脅迫對乳酸菌活力及細胞膜流動性的影響Fig.8 Effect of cold stress on the membrane fluidity and cell viability of LAB during freeze－drying

從圖8可以看出，不同的脅迫溫度和處理時間對凍干后菌體活力，細胞膜的熒光偏振度(P)和細胞膜微粘度(η)的影響不同，但是變化的趨勢較為一致，其中經過4℃、2h處理后，冷凍干燥菌體的熒光偏振度(P)和細胞膜微粘度(η)最小，分別為0.328 ±0.007，5.05±0.35，說明此時的細胞膜流動性最好。同時，菌體發酵的pH最低為5.35，說明菌體的活力最好。與之相反的是經過4℃、4h處理后，P和η分別達到最大，此時的菌體活力最小，以上結果說明細胞膜流動性與菌體活力有一定的相關性。

3 結論

利用DPH為熒光探劑，測定羅伊氏乳酸桿菌細胞膜流動性的方法是可行的，其最佳測定條件為:激發波長360nm，發射波長430nm，菌濃度為OD 0.8，30℃孵育時間為20min。羅伊氏乳酸桿菌經過4℃、3h和4℃、2h冷凍脅迫處理后，提高了菌體冷凍干燥的存活率。通過分析冷凍干燥后菌體的細胞膜流動性及細胞活力，細胞膜流動性與細胞活力具有一定的相關性，其中菌體經過4℃、2h冷凍脅迫后菌體的活力及流動性都相對于對照組有所提高。

［1］高永貴，姚善徑，楊賢強.DPH標記法研究自由基對活細胞膜流動性的影響［J］.化工學報，2000，51(12):182－185.

［2］高瑀瓏，鞠興榮，邱偉芬，等.超高壓對大腸桿菌細胞膜流動性的影響［J］.中國農業科學，2009，42(4):1365－1371.

［3］Ritz M，Tholozan J L，Federighi M，et al.Morphological and physiological characterization of Listeria monocytogenes subjected to high hydrostatic pressure［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(5):2240－2247.

［4］Ritz M，Tholozan J L，Federighi M，et al.Physiological damages of Listeria monocytogenes treated by high hydrostatic pressure［J］.Internal Journal of Food Microbiology，2002，79:47－53.

［5］張英華，霍貴成，郭鸰.乳酸菌冷凍干燥技術研究進展［J］.東北農業大學學報，2005，36(6):799－803.

［6］BealC.Resistance to freezing and frozen storage of Streptococcus thermophilus is related to membrane fatty acid composition［J］.J Dairy Science，2001，84:2347－2356.

［7］Jeffery R，Broadbent，Chan Lin.Effect of heat Shock or cold shock treatment on the resistance of lactococcus lactis to freezing and lyophilization［J］.Cryobiology，1999，39:88－102.

［8］G I Martos，C J Minahk，G Font de Valdez.Effects of protective agents on membrane fluidity of freeze－dried Lactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus［J］.Letters in Applied Microbiology，2007，45:282－288.

Effect of cold stress on membrane fluidity of Lactobacillus reuteri during freeze－drying

LI Bao－kun1，2，TIAN Feng－wei1，LIU Xiao－ming1，ZHAO Jian－xin1，ZHANG Hao1，SONG Yuan－da1，CHEN Wei1，*
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.School of Food，Shihezi University，Shihezi 832000，China)

The 1，6－diphenyl－1，3，5－hexatriene(DPH)was used as fluorescence probe to label the membrane of Lactobacillus reuteri.The optimum conditions were established to measure the membrane fluidity of L.reuteri by labeling with DPH:excitation wavelength 360nm，emission wavelength 430nm，adjust OD600of L.reuteri to 0.8，incubateed at 30℃ in the dark for 20 min.Meanwhile，the survival rates，viability and membrane fluidity of L.reuteri were measured after cold stress during freeze－drying.The results showed that the survival rates of freeze－drying Lactobacillus reuteri were improved by cold stress.At same time，the membrane fluidity was changed.The results implied that cold stress could improve cryotolerance of L.reuteri and prevent damage of freeze－drying.

cold stress;Lactobacillus reuteri;DPH;membrane fluidity;freeze－drying

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0137－04

細胞膜是細胞生命活動的必需組織，細胞膜的正常生理功能有賴于膜結構的完整和膜脂的恒定流動，細胞膜的流動性是其重要的動力學特征，與生物體的生命活動密切相關［1］。適宜的流動性是保證細胞處于正常生理狀態的重要條件。流動性的改變給細胞正常的生理活動帶來不利的影響，使細胞膜生理功能發生障礙［2－4］。冷凍干燥是益生菌發酵劑最常用的一種保藏方式，在冷凍干燥的過程中會改變細胞流動性，引起細胞活力的下降［5－6］。近年來，一些研究發現，在冷凍干燥前進行脅迫處理如冷脅迫，熱脅迫處理后可以提高菌種的冷凍干燥存活率［7］。1，6－二苯基－1，3，5－己三烯(DPH)是一種比較敏感的熒光探劑常用于研究膜脂流動性［8］，本研究將利用DPH對羅伊氏乳酸桿菌進行標記，測定細胞膜流動性，其研究目的主要有三個方面:a.優化DPH熒光標記羅伊氏乳酸桿菌細胞膜流動性測定條件;b.評價冷脅迫對羅伊氏乳酸桿菌冷凍干燥存活率的影響;c.分析冷脅迫后冷凍干燥乳酸菌細胞膜流動性及活力的相關性，從細胞水平上分析冷脅迫對冷凍干燥乳酸菌的作用機制。

2011－08－23 *通訊聯系人

李寶坤(1979－)，男，講師，在讀博士研究生，研究方向:食品微生物學。

國家自然基金(20836003，30871952);“十一五”國家科技支撐計劃重點項目(2009BADC1B02，2009BADB9B05);“十二五”國家“863”計劃(2011AA100901，2011AA100902)。