熱痹康湯對膠原誘導性關節炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影響*

★ 劉歡 龐學豐 吳燕紅 唐麗萍 龍朝陽 潘燕 王乾 (廣西中醫學院附屬瑞康醫院 南寧530011)

類風濕關節炎(Rheumatiod Arthritis，RA)是一種以侵犯外周關節為主的自身免疫性疾病，以關節滑膜的慢性炎癥為主要表現，其發病可能是一種受抗原驅動的“激發-鏈鎖反應”的過程，感染和自身免疫反應是類風濕關節炎發病和病情遷延的中心環節［1］。雖然目前對RA的病因學還不是十分清楚，但活動期的RA患者血清中IL-1β水平增高，IL-4水平降低，提示IL-1β、IL-4在RA的發病過程中起著重要的作用。本研究采用牛Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡCollagen，CⅡ)誘導大鼠關節炎模型(Collagen induced arthritic rats，CIA)，觀察熱痹康湯對大鼠血清IL-1β、IL-4的調節作用，探討熱痹康湯治療類風濕關節炎的作用機理。

1 材料與藥物

1.1 材料

60只Wistar大鼠，清潔級，動物合格證號:桂醫動字第17014號。體重100±10g，雌性，購于廣西中醫學院實驗動物中心;牛II型膠原蛋白、弗氏不完全佐劑購于Chondrex(美國)公司;IL-1β、IL-4試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗藥物

甲氨蝶呤(MTX)為上海醫藥(集團)有限公司信誼制藥總廠產品。熱痹康湯(組成:秦艽15 g、防風 10 g、桂枝10 g、威靈仙10 g、制川烏10 g、地龍10 g、桑枝 15 g、葛根 15 g、忍冬藤 15 g、青風藤 15 g、黃柏20 g、蒼術15 g)，制備后濃度為每毫升湯劑含生藥0.8 g，由廣西中醫學院附屬瑞康醫院制劑室制備提供。

2 方法

2.1 實驗動物造模及分組

60只大鼠適應性喂養7天后，隨機選取10只為正常對照組，其余50只參照文獻［2］方法造模。在無菌條件下，用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解牛II型膠原蛋白，濃度為4 mg/L，置4℃冰箱過夜后，再與等體積弗氏不完全佐劑(1 mg/mL)混合、震蕩至充分乳化，制成C II乳劑，置4℃冰箱保存備用。試驗時于每只大鼠頸、背部多點皮內注射0.25 ml致炎，于14 d后按上述方法和劑量再次免疫。根據大鼠關節炎臨床指征評分，確定免疫成功后(5分或以上)隨機分為5組:①模型組10只;②甲氨蝶呤組10只;③熱痹康湯高劑量組10只;④熱痹康湯中劑量組10只。⑤熱痹康湯低劑量組10只。

2.2 給藥方法

正常對照組，自由飲水;模型組以生理鹽水2 ml/100g灌胃，每日1次;甲氨蝶呤組灌服甲氨蝶呤藥液1 mg/kg(為60kg成人臨床用藥量換算得出)，每只灌服約0.1 mg，每周灌服1次;熱痹康湯高、中、低劑量組(高、低劑量組用藥劑量分別為正常組用藥劑量的2倍、0.5倍)，分別以熱痹康湯(含生藥1.6、0.8、0.4 g/ml)2 ml/100g，每日分 2 次灌胃。

3 檢測項目及方法

3.1 關節腫脹指數

參照文獻［3］采用0－4級關節評分法。0分:無關節炎;1分:小趾關節輕度腫脹;2分:小趾關節和足跖腫脹;3分:踝關節以下的足爪腫脹;4分:包括踝關節在內全部關節腫脹;關節指數積分越高，關節癥狀越嚴重。給藥前、治療后1周、2周、4周各觀察1次，并做好記錄。

3.2 IL-1β 及IL-4的檢測

造模成功后分組給藥，治療28d后，將各組大鼠麻醉，腹主股動脈抽血，分離血清，－20℃保存待測。IL-1β、IL-4的測定采用ELISA試劑盒，并按試劑盒說明進行檢測。

3.3 統計學處理

4 結果

4.1 關節腫脹指數觀察

治療第2周時，各組指數低于模型組，其中甲氨蝶呤、熱痹康湯高、中劑量組與模型組有顯著性差異(P＜0.05)。治療第4周時，各組指數低于模型組，與模型組均有顯著性差異(P＜0.05)。結果見表1。

表1 各組關節腫脹指數(±s)

表1 各組關節腫脹指數(±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05。

組別 n 給藥前 治療后1周 治療后2周 治療后4周10 0 0 0 0模型組 10 3.54 ±0.71 3.62 ±0.44 3.64 ±0.42 3.16 ±0.24甲氨蝶呤組 10 3.76 ±0.31 3.51 ±0.43 2.84 ±0.94* 1.64 ±0.36*熱痹康湯高劑量組 10 3.88 ±0.57 3.54 ±0.49 2.22 ±0.52* 1.24 ±0.71*熱痹康湯中劑量組 10 3.94 ±0.67 3.48 ±0.26 2.42 ±0.72* 2.21 ±0.84*熱痹康湯低劑量組 10 3.87 ±0.46 3.24 ±0.45 2.72 ±0.61 2.25 ±0.42空白組*

4.2 血清IL-1β、IL-4測定 治療4周后各給藥組與模型組相比，IL-1β水平降低，IL-4水平升高，都有顯著性差異(P＜0.01)。結果見表2。

表2 血清IL-1β、IL-4測定(±s，n=10)

表2 血清IL-1β、IL-4測定(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P ＜0.01。

組別 IL-1β/pg·ml－1 IL-4/pg·ml －1 59.06 ±40.56 19.72 ±8.14模型組 486.45 ±103.42 27.95 ±14.52甲氨蝶呤組 256.86 ±86.45* 49.72 ±21.64*熱痹康湯高劑量組 126.44 ±90.13* 158.44 ±46.38*熱痹康湯中劑量組 261.89 ±57.23* 67.79 ±26.74*熱痹康湯低劑量組 301.19 ±25.36* 45.87 ±35.64空白組*

5 討論

類風濕關節炎是一種以關節滑膜炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性結締組織疾病，滑膜炎可反復發作，導致關節軟骨及骨質破壞，最終導致關節畸形及功能障礙，目前尚無理想的根治方法，化學合成的藥物毒副作用大，患者常難堅持。中醫藥對RA的研究有著悠久的歷史，且副作用小、療效顯著，已被越來越多的患者接受。近年來，中醫藥防治RA的實驗研究也取得了一定的成果，從而為中醫藥防治本病提供了基礎和依據。

其發病機理比較復雜，近年來，人們研究發現炎癥性細胞因子廣泛參與RA病理變化的各個階段。對其進行深入的研究，一方面可以通過對該病發病機制的認識來了解疾病的發生、發展及預后，更重要的是可以對該病的生物學治療提供理論依據。通過阻斷主要細胞因子或細胞因子信號傳遞的主要環節來研究新的治療藥物是當前RA藥物治療的熱點。IL-1β是一種具有廣泛生物學活性的促炎性細胞因子，可以調節多種細胞因子、細胞粘附分子、免疫調節分子和前炎性介質的表達，在多種疾病的發生發展中發揮著重要作用［4］。已有研究發現IL-1β基因多態性影響疾病對治療的反應［5，6］。IL-1β 是參與RA滑膜炎癥和軟骨、骨破壞的主要炎性介質，血清IL-1的水平與RA的活動性及組織形態學特征密切相關［7］，而IL-1β基因啟動子區-511位點 C-T多態性能影響IL-1β的分泌量，進而影響RA病情及預后［8］，因此可將IL-1β基因作為研究RA患者對藥物反應個體差異的遺傳候選基因之一。

IL-4作為 Th2型細胞因子，選擇性的激活STAT6，使Th0向Th2極化，分泌IL-4等Th2細胞因子，形成自身正反饋調節。Aarvak等［9］發現RA患者滑膜中Th2克隆在IL-12和IL-4單抗的作用下轉化為Th0/Th1型，而Th0/Th1克隆在IL-4與IL-12單抗作用下穩定不變。此外，IL-4可以對抗IFN-γ和IL-17，而且IL-4和IL-12單抗可引發Th1/Th2在多克隆T細胞中的平衡，這是可能是由于記憶CD8+T細胞的增多和記憶CD4+T細胞的減少。IL-4對膠原誘導的關節炎 (Collagen-induced Arthritis，CIA)的進展起抑制作用，在 Thl/Th2(Th，helper T cell，輔助T細胞)平衡中，誘導Th2細胞因子轉換，調節Thl細胞因子表達［10－13］，而IL-4對CIA 的保護作用，可能與阻止促進CIA進展的細胞致炎因子和腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達有關，Lubbers等［14］認為局部IL-4治療可阻止關節損傷和骨侵蝕，這種保護作用與破骨樣細胞形成因子IL-17、IL-6、IL-12以及關節炎骨蛋白整合素下調有關。

熱痹康湯是龐學豐主任醫師治療濕熱型活動期類風濕關節炎的經驗方，由秦艽、防風、桂枝、威靈仙、制川烏、地龍、桑枝、葛根、忍冬藤、青風藤、黃柏、蒼術組成，具有清熱利濕、除痹止痛功效。臨床應用熱痹康膠囊治療濕熱型類風濕關節炎患者，發現能明顯降低患者的血沉、C反應蛋白、類風濕因子、免疫球蛋白，能明顯改善患者的晨僵、關節疼痛、關節腫脹、關節壓痛及關節功能，長期應用發現療效肯定，無明顯毒副作用，且具有免疫調節作用［15］。

本實驗采用熱痹康湯和甲氨蝶呤進行對照研究，治療后血清IL-1β水平和關節腫脹指數呈相應降低，血清IL-4水平相應升高，關節炎的癥狀逐漸減輕，兩者與模型組比較，均有顯著性差異(P＜0.01)，其作用與甲氨蝶呤相當。結果提示熱痹康湯能減輕膠原誘導性關節炎大鼠關節腫脹指數，降低IL-1β水平，升高IL-4水平，從而減輕關節滑膜的炎癥，抑制關節滑膜增殖，是其治療類風濕關節炎的作用機理之一。

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