B型煙粉虱羧酸酯酶對6種寄主植物時間響應的初步研究

柴芳華，韓詩疇，安新城*

(1．中國科學院華南植物園，廣州510650;2．廣東省昆蟲研究所，廣州510260;3．中國科學院研究生院，北京100049)

煙粉虱Bemisia tabaci是粉虱科Aleyrodidae小粉虱屬Bemisia的一種植食性昆蟲，原產于熱帶亞熱帶地區，最早由Gennadius在希臘的煙草上發現(Gennadius，1889)。它是一種極端廣食性的昆蟲，寄主范圍多達900余種 (Brown et al.，1995)，被世界公認為“超級害蟲”。它不僅能夠通過刺吸植物的汁液，導致植物衰弱和干枯，分泌蜜露誘發煤污病，影響植物光合作用，煙粉虱還是許多病毒的媒介，傳毒種類多達40余種 (Oliveira et al.，2001)。煙粉虱有著異乎尋常的寄主適應能力，這是它寄主譜廣的重要原因。每年由煙粉虱對全球蔬菜、瓜果、花卉以及經濟作物造成的損失高達數十億美元 (Byrne and Bellows，1991;Secker et al.，1998)。

植食性昆蟲與寄主植物通過長期的協同進化，形成了相互選擇、相互作用、相互適應的關系。寄主植物通過分泌有毒次生物質以及調節自身的營養結構等措施來抵御昆蟲的取食;而昆蟲則通過調節自己的行為機制、生理機制、分子生態機制等策略來適應不同的寄主植物 (Wan et al.，2009)，生理機制是煙粉虱最主要的寄主適應機制之一。有研究指出，煙粉虱體內解毒酶的活性可被寄主植物的次生物質誘導增加，從而增強煙粉虱的寄主適應性以及抗藥性。煙粉虱在解毒代謝過程中，多功能氧化酶、谷胱甘肽S轉移酶、非特異性酯酶、細胞色素P450等組成了昆蟲主要的外源化合物防御體系，對于進入昆蟲體內的植物毒素或合成農藥進行有效地降解、阻隔或異化，使其轉變為無毒或低毒的化合物，從而保障昆蟲體內代謝環境的穩定性 (Li et al.，2007;Lindroth，1989)。研究表明，羧酸酯酶可能是煙粉虱化學防御體系中最為重要的一類解毒酶系，在寄主適應性、農藥抗性、激素調節、發育代謝等過程中廣泛地發揮著作用 (Gao，1992;Byrne et al.，1993;Byrne et al.，2000)。本實驗通過研究B型煙粉虱在不同寄主植物上繁殖多代后，其體內羧酸酯酶的時間變化規律，旨在揭示煙粉虱適應寄主的生理機制，從而為更深層次的研究煙粉虱的寄主適應機制、抗藥性機制、種群爆發機制以及防治策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

B型煙粉虱:供試煙粉虱來源于廣東省昆蟲研究所養蟲室內黃瓜Cucumis sativus寄主上繁殖的實驗種群，分別轉移至苦瓜Momondica charantia、木瓜 Carica papaya、水瓜 Luffa acutangula、薄荷Mentha haplocalyx、金銀花Lonicera Japonic上飼養超過40天的B型煙粉虱。

植物材料:在自然條件下生長的黃瓜、苦瓜、水瓜、木瓜、薄荷、金銀花。

1.2 試劑與儀器

α－乙酸萘酯 (α－Naphthylacetate)、牛血清蛋白 (AlbuMin bovine V)(BSA)、α－萘酚 (1－Naphthol)、毒扁豆堿 (Eserine)、考馬斯亮藍G－250(Coomassie Brilliant Blue G250)、固藍 B鹽(Fsat blue Bsalt)、十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate，SDS)，均購自Sigma公司。低溫高速離心機 (型號3K15)，美國sigma公司產品;VICTORTM3多標記微孔板檢測儀，美國－PerkinElmer公司產品。

1.3 煙粉虱寄主轉移的處理

讓煙粉虱在自然生長的黃瓜樣地里繁殖多代后，分別放幾盆苦瓜、水瓜、木瓜、薄荷、金銀花，讓黃瓜寄主上的煙粉虱自由擴散到這些非嗜好性寄主植物上，再把這些植物移出黃瓜樣地，放置在自然條件下單獨種植。煙粉虱在其上自由繁殖40 d左右后，便開始分時間段取各種植物上的煙粉虱進行羧酸酯酶活性的測定。由于每種植物的生長周期有別，導致寄主植物上的落蟲量有差別，各種寄主植物上煙粉虱的采集時間存在一定差異。

1.4 羧酸酯酶活性的測定方法

羧酸酯酶活性測定的原理:用α－萘酚制作標準曲線。底物α－乙酸萘酯在羧酸酯酶 (CarE)的作用下發生水解反應，生成的α－萘酚與顯色劑固藍B鹽生成深藍色或深紅色物質，在595 nm處比色測定其吸光度 (OD值)。

CarE酶源制備:取大小一致的供試煙粉虱20頭，在0.04 mo1/L pH為7.0的磷酸緩沖液中清洗，然后將其轉移到玻璃勻漿器中，加入1 mL 0.04 mo1/L pH為7.0的磷酸緩沖液 (PBS)冰浴勻漿，勻漿液在4℃下，10000 r/min離心10 min，取上清液作為酶源。

測定方法:參照Van Asperen(1962)的方法，略加改進。取待測酶液0.1 mL，加0.5 mLα－乙酸萘酯 (含終濃度為lx10－5mol/L的毒扁豆堿液)混勻，在30℃下水浴反應10 min后加入0.1 mL顯色劑并終止反應，顯色30 min。測定使用96孔可拆卸式酶標板，每孔加200μL反應終止液，每組反應液加3孔，借助酶標儀于595 nm測定反應終止液的OD值。以失活酶液做對照，通過α－萘酚標準曲線求出反應生成的α－萘酚的量。每個處理重復3次。

酶源蛋白質含量的測定:參照Bradford(1976)考馬斯亮藍 G250法。取0.1 mL待測酶液，加0.5 mL考馬斯亮藍G－250染色液，混合均勻后2 min至1 h內測OD595值。根據標準曲線求出酶液蛋白質含量。

羧酸酯酶比活力的計算公式:羧酸酯酶的比活力 (nmol·min－1·mgPro－1)=反應生成的 α －萘酚量/(酶液蛋白質含量*反應時間)。

2 結果與分析

煙粉虱在苦瓜、黃瓜、木瓜、水瓜、金銀花、薄荷六種寄主植物上，從7月至10月的時間段內，其羧酸酯酶比活力隨時間的變化趨勢，如圖1－6。

從圖中可以看出，煙粉虱在不同寄主植物上羧酸酯酶比活力隨時間的變化趨勢，用二項式曲線進行擬合，其相互關系較為一致地呈開口向上的拋物線型?？喙霞闹鞯亩検角€為:y=0.012x2－979.0x+2E+07，相關系數R2=0.667;黃瓜寄主的二項式曲線為:y=0.012x2－1046.x+2E+07，相關系數R2=0.888;木瓜寄主的二項式曲線為:y=0.020x2－1661.x+3E+07，相關系數R2=0.867;水瓜寄主的二項式曲線為:y=0.029x2－2431.x+5E+07，相關系數R2=0.994;薄荷寄主的二項式曲線為:y=0.028x2－2303.x+5E+07，相關系數R2=0.831;金銀花寄主的二項式曲線為:y=0.014 x2－1184.x+2E+07，相 關 系數R2=0.951。

圖6 金銀花寄主上煙粉虱羧酸酯酶比活力變化趨勢Fig.6 Time variation tendency of CarE specific activity of Bemisia tabaci on Lonicera Japonic

3 結論與討論

煙粉虱從嗜食寄主轉移到非嗜食寄主植物過程中，其解毒酶系通常會表現出活性增加的趨勢，在已有研究中，多功能氧化酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽－S－轉移酶、乙酰膽堿酯酶等都受植物的影響而表現出不同程度的差異，基本上與煙粉虱的寄主適應性關系相一致 (王海鴻等，2007;王紅等，2007;周福才等，2010)，但是卻未提到解毒酶活性與時間相關性及趨勢的研究報道。

本實驗的研究結果表明，煙粉虱從嗜好寄主(黃瓜)轉移至非嗜好寄主 (苦瓜、木瓜、水瓜、薄荷、金銀花)后，其羧酸酯酶的活性雖有顯著增加的趨勢 (另文發表)，但其變化規律卻在整體上與時間相關，這與預期不一致，其規律性在嗜好寄主黃瓜上也表現的較為典型。周福才等在轉移至棉花、辣椒上后測得的煙粉虱羧酸酯酶在2～3代后達至平衡，但本實驗結果的酶活性增加趨勢卻并非是對數曲線，而是更加符合開口向上的拋物線型，分析認為，這種趨勢可能暗示了寄主植物在生長季節過程中其次生物質含量發生了規律性的變化，該變化的誘導因子可能來自于其自身的發育代謝，也可能受環境因子的影響，而與周福才等結果的不一致，則可能是由于本實驗的植物材料生長在接近自然的室外環境中，更多地受外界環境的影響而使植物次生物質的代謝發生了更為復雜的變化而導致?？傊?，煙粉虱在寄主植物取食過程中，其包括羧酸酯酶在內的解毒酶系與植物次生物質之間可能存在著緊密的互動關系，反復而細致地研究其聯動機制將有助于我們更好地理解煙粉虱的寄主植物生理適應機制。

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