在北京和河北局部地區Q型煙粉虱取代了B型煙粉虱

潘慧鵬, 戈大慶, 王少麗, 吳青君, 徐寶云, 謝 文, 張友軍

(中國農業科學院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

煙粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]屬半翅目,粉虱科,是一種世界性的多食性害蟲,以植物韌皮部汁液為食,通過直接刺吸為害、傳播植物病毒、引起植物生理混亂、分泌蜜露誘發真菌病害給作物生產造成巨大的經濟損失[1-2]。依據其寄主范圍、生殖力、為害習性和傳毒能力等方面的差異,至少可以分為24種生物型[3],其中B型煙粉虱是近20年來傳播世界各地并暴發成災的重要入侵害蟲[3-6],在我國華北和其他地區發生并造成嚴重的危害[7],應用分子生物學等手段研究發現在北京市發生為害的煙粉虱主要是B型煙粉虱[8-11]。近年來,隨著花卉和其他經濟作物苗木的調運,Q型煙粉虱有從其起源地伊比利亞半島向世界各地擴張蔓延的趨勢。在中國,Q型煙粉虱首次于2003年在云南昆明市的一品紅上發現[12],隨后在北京、河南、浙江、山東、江蘇等地都發現了Q型煙粉虱[13-15]。

不同生物型的煙粉虱在形態學上極其相似,但在酯酶多態性、核酸多態性等方面則存在明顯的差異。而快速鑒定煙粉虱的生物型是進一步深入研究、制定相關防治措施的前提。本文利用兩種方法進行煙粉虱生物型的鑒定。第1種是Shatters,Jr等[16]設計的B型煙粉虱和Q型煙粉虱的mtDNA COⅠ基因片段特異性引物,PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接判斷煙粉虱的生物型。第2種是應用Simon等[17]設計的煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段通用引物,PCR產物通過測序判定煙粉虱的生物型。上述兩種方法都證實了2009年采集自蔬菜所3個試驗基地的煙粉虱種群為Q生物型,同時也驗證了Shatters,Jr等[16]設計的B型煙粉虱和Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段的特異性引物能夠很好地鑒別B型煙粉虱和Q型煙粉虱。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

所用的煙粉虱種群于2009年采自蔬菜所的3個試驗基地(表1);對照為本實驗室飼養的B型煙粉虱種群。

表1 2009年煙粉虱樣本來源及相關信息

1.2 酶和試劑

PCR試劑盒購自TaKaRa公司;DNA提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司;蛋白酶K、RNAase購自天根生化科技(北京)有限公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 DNA的提取

參考滕海媛[18]的方法并略作修改,將其方法中的第1步改為吸20μL裂解液于封口膜上,將1頭煙粉虱置于提取液中,用0.2 mL PCR管底部將煙粉虱充分研磨勻漿,把勻漿液吸入1.5 mL離心管中,再取40μL裂解液清洗封口膜研磨處,將清洗液與勻漿液合并。

1.4 PCR擴增及電泳

Q型煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR擴增特異性引物[16]分別為5′CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT 3′和 5′CCTTCCCGCAGAAGA-AATTTTGTTC 3′;B型煙粉虱 mtDNA COⅠ基因片段PCR擴增特異性引物[16]分別為5′CTAGGGTTTATTGTTTGAGGTCATCATATATTC 3′和 5′AATATCGACGAGGCATTCCCCCT 3′,PCR熱循環程序[16]為:94℃2 min,94℃30 s,64℃1 min,72℃1 min,共35個循環,最后72℃延伸10 min擴增產物大小分別為303 bp和478 bp。煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段 PCR擴增通用引物[17]分別為 5′TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT3′和 5′CTGAATATCGAGGCATTCC3′。PCR熱循環程序[13]為:94℃5 min,94℃1 min,50℃1 min,72℃1 min,共34個循環,最后72℃延伸5 min,擴增產物大小為620 bp。PCR產物用1.0%瓊脂糖(0.5×TBE)電泳檢測,在Biorad凝膠成像儀觀察,記錄結果。

1.5 序列測定與比較

用B型煙粉虱和Q型煙粉虱的特異性引物擴增后的電泳檢測結果判斷煙粉虱的生物型;對其中部分樣品應用煙粉虱mtDNA COⅠ基因片段通用引物擴增得到的PCR產物回收、純化后送到北京擎科生物技術有限公司進行雙向測序。通過同源性比較,鑒定所采集的煙粉虱種群的生物型。

2 結果與分析

2.1 Q型和B型煙粉虱特異性引物擴增結果

使用Q型煙粉虱特異性引物從3個地區采集到的煙粉虱中均擴增到1條303 bp大小的mtDNA COⅠ基因片段(圖1),應用B型煙粉虱的特異性引物可以從本實驗室飼養的B型煙粉虱中擴增到1條478 bp大小的mtDNA COⅠ基因片段(圖1)。

圖1 B型和Q型煙粉虱特異性引物對田間和溫室內煙粉虱的擴增結果

2.2 mtCOⅠ通用引物擴增結果

采用mtCOⅠ通用引物從田間采集的煙粉虱及溫室飼養的B型煙粉虱中均擴增到一條大小為620 bp的mtCOⅠ基因片段(圖2)。經回收、純化、測序,進行相似性比對后發現,從海淀區、昌平區及廊坊市采集到的煙粉虱種群與以色列Q型煙粉虱(登錄號為AY582869)、美國佛羅里達州B型煙粉虱(登錄號為EF080824)的相似性分別為99.85%、98.80%。所以2009年在海淀區、昌平區及廊坊市試驗基地發生為害的煙粉虱全部為Q生物型(圖3)。

3 討論

一些學者利用對mtDNA COⅠ基因測序和RAPD標記技術對北京部分煙粉虱種群進行了鑒定,發現在北京市發生為害的煙粉虱主要是B型煙粉虱[8-11],本實驗室已有的研究表明在2004年3個試驗基地發生為害的煙粉虱全部為B型[19],而本研究發現在北京市海淀區、昌平區及河北省廊坊市發生為害的煙粉虱為Q型,故Q型煙粉虱已經取代了B型煙粉虱在這些地區發生為害。然而,RAPD標記為顯性標記不能有效鑒別雜合子,同時易受反應條件的影響,穩定性較差;對mtDNA COⅠ基因測序能夠很好地鑒別煙粉虱生物型,但是這種方法費時、費力,并且價格昂貴。在本研究中,聯合使用B型和Q型煙粉虱mtCOⅠ基因特異性引物能夠快速地鑒別B型與Q型煙粉虱,該結果與Shatters,Jr等[16]的研究結論是一致的。因此,對于局部地區煙粉虱B型、Q型混合種群,使用這兩個特異性引物來快速鑒別這2種生物型具有一定的價值。

B型煙粉虱近20年來迅速入侵世界許多地區,并引起部分入侵地土著煙粉虱種群的下降或滅絕,從而成為最受關注的一個生物型[20-21]。而近年來Q型煙粉虱逐漸入侵到B型煙粉虱已經建立種群并暴發的地區,成為繼B型煙粉虱后另一備受關注的研究對象。

Nauen等[22]對采自歐洲不同地區的煙粉虱種群進行了抗藥性研究,結果發現,西班牙Almeria地區的Q型煙粉虱對吡蟲啉產生了大于100倍的抗性,除了對新煙堿類藥劑噻蟲嗪、啶蟲脒產生了較高的交互抗性,還對噻嗪酮、硫丹、久效磷等常用殺蟲劑有交互抗性。另外研究還發現來自意大利和德國的Q型煙粉虱種群在吡蟲啉、噻蟲嗪和啶蟲脒之間也存在較高的交互抗性;且Q型煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑的抗性更穩定,在未施加殺蟲劑選擇壓力的實驗室條件下,Q型煙粉虱對這類殺蟲劑的抗性在兩年后仍維持在較高水平[22]。Horowitz等[23]的研究發現,以色列地區的Q型煙粉虱對昆蟲生長調節劑類農藥如吡丙醚產生了很高的抗性。Roditakis等[24]的研究發現,采自地中?？死锾貚u的許多Q型煙粉虱種群都對吡蟲啉和高效氯氰菊酯產生了高抗性。上述研究結果表明,Q型煙粉虱對一些化學殺蟲劑能夠產生很強且穩定的抗藥性以及交互抗性。因此,Q型煙粉虱較B型煙粉虱治理的成本更高、難度更大。

自然條件下Q型煙粉虱競爭取代B型煙粉虱的假說很多。首先,Q型煙粉虱較B型煙粉虱對于很多種藥劑具有較高的抗藥性被很多學者認同[25],它可能決定了B型煙粉虱和Q型煙粉虱在田間的種群動態和擴張趨勢。如Q型煙粉虱在西班牙的自然條件下較B型煙粉虱發生量大、為害嚴重,尤其在昆蟲生長調節劑類農藥如吡丙醚和新煙堿類農藥廣泛使用的地區,B型煙粉虱已基本被Q型取代[25]。研究者推測Q型煙粉虱所具備的高抗藥性可能在其競爭取代B型過程中發揮了重要作用[25]。蔬菜所的3個試驗基地常年種植蔬菜,藥劑使用歷史較長,尤其在過去十幾年新煙堿類藥劑大量用于防治粉虱類害蟲。短短5年時間在蔬菜所基地作物上已經采集不到B型煙粉虱,并且目前蔬菜所番茄上發生的Q型煙粉虱對吡蟲啉的抗性是室內飼養B型煙粉虱的819.04倍(未發表),所以作者推測是因為Q型煙粉虱較B型煙粉虱對于很多種藥劑具有高抗性而導致Q型煙粉虱取代B型煙粉虱在蔬菜所基地作物上發生為害。但是在自然條件下不同地區煙粉虱生物型的轉換與農藥的關系尚需進一步深入研究。

其次,Q型煙粉虱較B型煙粉虱在一些雜草和部分農作物上具有更強的生物學優勢。比如:在小花錦葵(Malva parvif lora Linn.)、薺[Capsella bursa-pastoris(Linn.)Medic.]、田芥菜[Brassica kaber(DC)]3種不同的雜草上,Q型煙粉虱雌蟲產卵率、化蛹數、成蟲羽化率等均比B型煙粉虱明顯高[26];在不同品種的番茄上,Q型煙粉虱比B型具有更強的危害性[27];在甜椒上,Q型煙粉虱在17、33℃時平均世代歷期比B型的要短[27]。另外Q型煙粉虱較B型煙粉虱具有更強忍受極端溫度的能力[28],這也可能是Q型煙粉虱取代B型煙粉虱的一個重要因素。弄清楚溫度與煙粉虱種群動態之間的關系對于改進控制策略和評估它在不同地區之間的擴張能力也是非常重要的。

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