響應面法優化胡蘆巴種子多糖提取工藝

何彥峰，楊仁明，胡 娜，索有瑞，王洪倫*

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧810001;2中國科學院研究生院，北京100049

響應面法優化胡蘆巴種子多糖提取工藝

何彥峰1，2，楊仁明1，2，胡 娜1，2，索有瑞1，王洪倫1*

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧810001;2中國科學院研究生院，北京100049

利用單因素實驗及響應面法優化確定胡蘆巴種子多糖的提取工藝。通過單因素實驗篩選出料液比、提取時間、提取溫度三個主要因素，以胡蘆巴種子多糖提取得率為響應值進行Box-Behnken中心組合試驗設計，建立胡蘆巴種子多糖提取得率的二次回歸方程，得到優化組合條件。響應面法分析結果表明，當料液比為1∶28 (g:mL)，提取時間1.2 h，提取溫度85℃時驗證優化工藝得胡蘆巴種子多糖最大提取得率19.89%，接近于模型預測值20.24%。

胡蘆巴;多糖;響應面法;提取工藝

胡蘆巴(Trigonella foenum-graecum L.)，又名苦豆、香豆，豆科一年生草本植物，是一種集藥用、食用、香料和飼料等價值于一身的經濟作物。研究表明其主要含有甾體皂苷類、多糖類、氨基酸、生物堿、黃酮類等化學成分。胡蘆巴作為中藥具有溫腎助陽、催乳、健胃、驅寒止痛等功效［1，2］。近期研究表明，胡蘆巴具有降血糖和降血脂功能而被用來治療糖尿病、心腦血管疾病，并具保肝護肝的功能和抗氧化特性，其主要活性成分為胡蘆巴多糖［3-6］。同時，由于胡蘆巴多糖具有使食物增稠成型，保持食品色、香、味、結構和食品的相對穩定性等特性而廣泛應用于食品工業，并于1999年6月通過全國食品添加劑標準技術委員會第二十次年會的新品種審批，成為一種新的的增稠劑［7］。因此，研究和優化胡蘆巴多糖提取工藝對開發和利用胡蘆巴資源有重要意義。

本研究在單因素實驗的基礎上選擇料液比、提取時間、提取溫度3個主要因素，用苯酚-硫酸法繪制標準曲線，以多糖提取得率為依據，采用響應面法對青海產胡蘆巴種子多糖提取工藝進行了優化。以期為研究胡蘆巴種子多糖的提取工藝路線提供參考，為胡蘆巴資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘆巴種子2010年8月采自青海省大通縣，由中國科學院西北高原生物研究所周昌范高級工程師鑒定;石油醚、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、濃硫酸、苯酚和葡萄糖均為分析純。

1.2 儀器與設備

DFY1000C高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司;101-1ES電熱鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器廠;優普UPT系列超純水器，成都超純科技有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;UV-759紫外-可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;ALC-110.4型電子天平，德國Acculab公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制作、多糖含量測定［8，9］

精確稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖標準品0.1 g，純水定容至1000 mL。精密吸取0.1 g/L的葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL試管中，依次加純水使最終體積為2 mL，然后分別加入5%的苯酚1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，靜置10 min，混勻放入30℃水浴加熱20 min，取出冷卻至室溫，用2 mL純水做空白，于490 nm波長處測樣品的吸光度(A)，以多糖濃度(C，g/ mL)為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標，繪制標準曲線。用最小二乘法計算得到回歸方程A=0.0102C +0.0815(r=0.9993)。

1.3.2 胡蘆巴種子多糖的提取與含量測定

取300 g干燥的胡蘆巴種子，用高速萬能粉碎機粉碎，過0.25 mm篩，使用石油醚索氏提取3次，每次2 h，揮干石油醚后在干燥箱中30℃烘干，備用。精確稱取處理好的胡蘆巴種子粉末1.0 g置于250 mL圓底燒瓶中，按照一定的料液比、提取溫度、提取時間和提取次數進行加熱回流提取，提取完成后3500 rpm離心15 min，上清液用sevage法除蛋白3次，再用3倍體積95%乙醇4℃沉淀24 h，然后將沉淀溶解定容至100 mL容量瓶，按照1.3.1中的步驟測定多糖的吸光度，代入標準曲線方程計算種子多糖含量，并以下式計算提取得率:

多糖提取得率(%)=(胡蘆巴種子多糖含量/胡蘆巴種子質量)×100%

1.4 實驗設計與數據分析方法

1.4.1 單因素實驗設計

在進行響應面分析之前，先通過單因素實驗選出對胡蘆巴種子多糖提取得率具顯著影響的因素，并確定其試驗水平。參考相關文獻，本文稱取1.0 g胡蘆巴種子，考查了不同的料液比(1∶15～1∶35)、提取溫度(50℃ ～90℃)、提取時間(0.5 h～2.5 h)和提取次數(1～4次)對胡蘆巴種子多糖提取得率的影響。

1.4.2 響應面法實驗設計與數據分析方法

根據Box-Benhnken實驗設計原理，選擇影響胡蘆巴種子多糖提取得率(Y)的3個主要影響因素:料液比(X1)、提取時間(X2)、提取溫度(X3)進行組合。以-1、0、1代表自變量水平，xi為自變量的編碼值;Xi為自變量的真實值;其關系為xi=(Xi－X0)/ ΔX。其中，X0為試驗中心點處自變量的真實值;ΔX為自變量的變化步長［10］。試驗因素及水平編碼見表1，具體實驗設計方案見表2。

表1 Box-Behnken設計因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

采用Design expert 8.0軟件對實驗數據進行回歸分析，擬合二次多項式方程。多項式模型方程擬合可靠性由R2表達，R2越接近于1，則多項式模型與實際擬合可靠性越高;其統計學上的顯著性由F值檢驗，F值越大表明該變量對因變量的影響越顯著;因素的線性效應、平方效應及其交互效應的顯著性由模型系數的P值檢驗，概率P值越小，則相應變量的顯著程度越高，P＜0.01時影響為極顯著，P＜0.05影響顯著［11］。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對多糖提取得率的影響

設定提取溫度為80℃，提取時間為1.5 h條件下，以料液比對多糖提取得率做單因素試驗。設計料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。結果表明，多糖提取得率隨料液比的增加而呈上升趨勢，但料液比在1∶25之后多糖提取得率增長緩慢。從成本和時間方面考慮，料液比選擇在1∶25～1∶30之間為宜。

2.1.2 提取溫度對多糖提取得率的影響

設定提取時間為1.5 h，料液比為1∶25條件下，以提取溫度對多糖提取得率做單因素試驗。設計提取溫度為50、60、70、80、90℃。結果表明，在小于80℃時，隨著溫度的升高，多糖提取得率逐漸增加，且增幅明顯，80℃時達到最大，之后略顯下降。這一趨勢可能是由于溫度過高，胡蘆巴多糖的結構被破壞，使其得率下降。因此選擇溫度為80℃左右為宜。

2.1.3 提取時間對多糖提取得率的影響

設定提取溫度為80℃，料液比為1∶25條件下，以提取時間對多糖提取得率做單因素試驗。設計提取時間0.5、1、1.5、2、2.5 h。結果表明，多糖得率隨時間的增長呈上升趨勢，1.5 h附近達到最大，之后趨于平緩，為減少能耗，節約時間，提取時間選擇1.5 h為宜。

2.1.4 提取次數對多糖提取得率的影響

設定提取溫度80℃，料液比1∶25(g:mL)，提取時間1.5 h條件下，以提取次數對多糖提取得率做單因素試驗。結果表明，提取兩次后多糖提取得率基本保持不變，考慮到生產效率，選擇提取兩次為宜。

2.2 響應面法優化胡蘆巴種子多糖提取工藝

2.2.1 響應面分析方案與結果

對胡蘆巴種子多糖提取工藝進行響應面分析，其具體試驗方案及結果見表2。

表2 多糖提取工藝條件的優化試驗設計及結果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA of regression analysis

采用Design-Expert8.0軟件對各因素進行回歸擬合，得回歸方程方程:多糖提取得率=19.47+ 1.43×X1+0.86×X2+1.65×X3-0.87×X1X2-0.84 ×X1X3-0.67×X2X3-1.13×-1.39×-1.64×

由表3可知，方程中除X2X3(時間和溫度兩因素的交互作用)無顯著影響外，三因素的其它交互項、線性及其平方項對多糖提取得率均達到極顯著水平(P＜0.01)，三因素與響應值之間線性關系極為顯著;R2=0.985表明該二次回歸得到的多糖提取得率模型與實際擬合較好，符合度為98.50%，表明使用該方程模擬實際的三因素三水平分析是可行的。同時，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對多糖提取得率影響的排序為提取溫度(X3)＞料液比(X1)＞提取時間(X2)。

2.2.2 因素間的交互影響

根據擬合模型繪制胡蘆巴種子多糖的響應面的三維圖與等高線，可直觀地看出響應面的最高點，即參數范圍內的極值以及因素間的相互作用對響應值的影響，依次可以確定最佳工藝參數范圍。Design-Expert8.0軟件處理后三維響應面和等高線圖見圖1～3。

圖1 Y=f(X1，X2)的響應面與等高線Fig.1 Responsive surfaces and contours of Y=f(X1，X2)

圖1為提取溫度為80℃時不同提取時間和料液比對胡蘆巴種子多糖提取得率的影響，從圖中可知，在提取時間較長，料液比較大的范圍內可以達到響應值的最高點。

圖2為提取時間為1 h時不同提取溫度和料液比對胡蘆巴種子多糖提取得率的影響。從圖中可知，提取溫度和料液比較低時，多糖提取得率較低，但提取溫度過高，料液比較大時也會導致多糖的提取得率下降，這可能是由于溫度過高會破壞多糖結構致使多糖檢測量下降。

圖3為料液比為1∶25時不同提取時間和提取溫度對胡蘆巴種子多糖提取得率的影響，從圖中可知，在長時高溫的提取條件下，樣品中的雜質會伴隨多糖一起被提出來，從而導致多糖提取得率的下降。

總的來看，提取溫度對多糖提取得率的影響最為顯著，在所選溫度范圍內，隨著提取溫度的不斷增高，多糖的提取得率也隨之增大，表現為曲面較陡，而提取時間和料液比的影響次之，曲面較平緩。

2.3 胡蘆巴種子多糖提取工藝條件的確定

通過軟件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最優提取工藝條件為:料液比為1:28.28，提取時間為1.16 h，提取溫度為84.85℃，胡蘆巴種子多糖的提取得率可達20.24%?？紤]到實際操作的可行性，同時又達到節省時間與能耗并取得最佳效果的目的，將胡蘆巴種子多糖的提取工藝條件修正為:料液比1∶28，提取時間為1.7 h，提取溫度85℃。

按上述最佳工藝即料液比1∶28，提取時間為1.2 h，提取溫度85℃提取胡蘆巴種子多糖(n=3)以驗證響應面法的可行性。結果，平均提取得率為19.89%，與預測值20.24%比較，基本吻合，比單因素平均提取率高4.87%。

3 結論

本文在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對胡蘆巴種子多糖提取工藝進行了優化。通過回歸方程優化得胡蘆巴種子多糖的最佳提取工藝為:料液比1∶28，提取時間為1.2 h，提取溫度85℃，此條件下胡蘆巴種子多糖平均提取得率為19.89%?；貧w分析和驗證試驗結果表明，采用響應面法優化胡蘆巴種子多糖的提取工藝條件，得到的多糖提取工藝流程具有實際應用價值。

1 China Pharmacopoeia Committee(國家藥典委員會).Ch.P.，Vol.1(中國藥典，一部).Beijing:Chemistry Industry Press，2010.225.

2 Jing Y(荊宇)，Zhao YQ(趙余慶).Progress in studies on chemical constituents and pharmacological effect of Trigonella foenum-graecum.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2003，34:1146-1149.

3 Xue WL，Li XS，Zhang J，et al.Effect of Trigonella foenumgraecum(fenugreek)extract on blood glucose，blood lipid and hemorheological properties in streptozotocin-induced diabetic rats.Asia Pac J Clin Nutr，2007，16:422-426.

4 Kaviarasan S.Fenugreek(Trigonella Foenum Graecum)seed extract prevents ethanol-induced toxicity and apoptosis in Chang liver cells.Alcohol and Alcoholism，2006，41:267-273.

5 Zhu BL(朱寶立)，Ban YH(班永紅)，Duan JA(段金廒).Protective effect of fenugreek seed on acute chemical liver injury.Chin J Industr Med(中國工業醫學雜志)，2000，13: 19-21.

6 Hamden K，Jaouadi B，Carreau S，et al.Inhibitory effect of fenugreek galactomannan on digestive enzymes related to diabetes，hyperlipidemia，and liver-kidney dysfunctions.Biotechnol Bioprocess Eng，2010，15:407-413.

7 Huo GH(胡國華).Application current situation and prospect of new type gums in China.China Food Additives Association Congress of the third member and the Ninth China International Food additives and Ingredients Exhibition(中國食品添加劑協會第三屆會員代表大會暨第九屆中國國際食品添加劑和配料展覽會).shanghai，2005.

8 Zhu L(朱磊)，Wang ZY(王振宇)，Zhou F(周芳).Study on optimization of microwave-assistant extraction of polysaccharides from Auricularia auricula by Response Surface Method.J Chin Inst Food Sci Technol(中國食品學報)，2009，9(2):53-60.

9 Dong Q(董群)，Zheng L(鄭麗伊).Modified phenol-sulfuric acid method for determination of the content of oligo-and polysaccharides.Chin Pharm J(中國藥學雜志)1996，31: 550-553.

10 Ye CL，J CJ.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Plantago asiatica L.by response surface methodology.Carbohydr Polym，2011，84:495-502.

11 Xu J，Chen W.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible Bachu mushroom by response surface methodology.Carbohydr Polym，2008，72:67-74.

Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.)by Response Surface Methodology

HE Yan-feng1，2，YANG Ren-ming1，2，HU Na1，2，SUO You-rui1，WANG Hong-lun1*
1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China; 2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences，Beijing，100049，China

Single-factor tests and response surface method(RSM)were used to optimize the extraction process of fenugreek seed polysaccharides(FSP).In order to obtaining the maximum of extraction yield of the polysaccharides，three main factors including extraction temperature，extraction times and ratio of raw material to water were selected with the Box-Behnken design and a quadric regression equation for predicting the yield of polysaccharides was established.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows:extraction temperature 85℃，extraction times 1.2 h，and ratio of raw material to water 1∶28.Under the conditions，the optimum extracting yield of FSP was 19.89%，which is well matched with the predictive extracting yield 20.24%.

fenugreek;polysaccharides;response surface methodology;extraction process

1001-6880(2012)10-1463-05

2012-01-04 接受日期:2012-03-29

中國科學院生命科學領域優秀青年科技專項(KSCX2-EW-Q-23)

*通訊作者 Tel:86-971-6143857;E-mail:hlwang@nwipb.cas.cn

TS255.36

A