葛根素對高糖誘導的乳大鼠心肌細胞細胞因子及鈣離子的影響

張 玲，許 薇，孫 媛，高俊虹

(1.遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001;3.中國中醫科學院針灸研究所，北京 100700)

糖尿病性心臟病(diabetic cardiomyopathy，DC)是糖尿病患者常見的慢性并發癥之一。近年來，心肌細胞因子和鈣離子在心血管疾病發病中的重要作用已日益受到重視。葛根素(Puerarin，Pue)為豆科植物野葛干燥根中的提取物。已有動物實驗表明，Pue在心血管方面有調節腎素-血管緊張素系統(RAS)、血漿內皮素(endothelin，ET)和一氧化氮(nitric oxide，NO)含量［1］，拮抗 β-腎上腺受體［2］，降低心肌細胞鈣離子濃度［3］等多方面作用。但因整體動物實驗影響的因素較多，且是否對高糖誘導的心肌細胞有影響少見報道。本實驗用培養的新生大鼠心肌細胞研究Pue對高糖誘導的心肌細胞 NO、ET和鈣離子的影響，為進一步Pue在DC方面的應用提供基礎及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品與試劑

出生2d～3d的SD大鼠乳鼠，雌雄不拘，由遼寧醫學院實驗動物中心提供(動物許可證號 SCXK(遼)2007-2011)。Fura-2、HEPES、低 糖 培 養 基DMEM、胰蛋白酶、MTT試劑均購自美國 Sigma公司;NO試劑盒購自南京建成生物工程公司;ET試劑盒購自北京放免技術研究所;Pue購自廣東燕塘生物化學藥業有限公司;小牛血清為杭州四季青生物材料研究所產品，其他試劑均為分析純。

1.2 大鼠乳鼠心肌細胞原代培養

取出生2d～3d的 SD大鼠乳鼠，雌雄不拘，引頸法處死動物。無菌條件下用75%乙醇消毒皮膚，開胸剪取心臟，放入盛有無血清培養液的冰冷容器，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次后，剪成1mm3大小的碎塊，加入0.6 g/L胰蛋白酶消化細胞。將消化完畢的細胞置入含有體積分數分別為0.15的小牛血清、0.84的 DMEM培養基及0.01的雙抗液(含100KU/L青霉素，100mg/L鏈霉素)的培養基。將細胞懸液吹打均勻，以1×108/L的密度接種于24孔培養板，送入5%CO2及95%空氣的 CO2孵箱中培養。

1.3 分組及給藥方法

常規培養心肌細胞2d～3d后，更換含0.4%小牛血清的培養基，以減少血清成分對實驗結果的影響。設不給藥組為空白對照組，其他組分別給藥:給予 25mmol/L 高糖(highglucose，HG)組、HG+10－3mol/L Pue組 (Pue先孵育30min)、25mmol/L HG+2×l0－3mol/L Pue組(Pue先孵育 30min)。繼續培養2d～3d后進行各項指標的測定。

1.4 MTT法測定心肌細胞的存活率

取1.3中經各藥物處理48h的細胞接種于96孔板中，加入 MTT(5 g/L)20μL，置 37℃5%CO2培養箱中孵育4 h后去除培養基后，加入150μl DMSO溶解結晶體，輕輕晃動15min～20min后，酶標儀在波長為490 nm處測定吸光度(A)值，用此計算細胞的存活率。

1.5 NO和ET濃度的測定

取細胞培養液，10000r/min，離心 10min取上清，硝酸還原酶法檢測各組NO濃度，放免法測定各組ET-1含量。

1.6 Ca2+的測定

將有自發性搏動的心肌細胞從培養板中取出，置于含有 Fura-2/AM(3μmol/L)的 DMEM培養基中，其中含有白蛋白0.2%，在37℃水浴中孵育30 min，用HEPES緩沖液沖洗后，放于熒光顯微鏡下的灌流槽中，恒溫37℃，用 HEPES緩沖液沖洗灌流，灌流速度為1mL/min，所有藥物均在指定時間加入灌流液中。所用的測定儀器為Till陽離子測定系統(德國)采用 DM3000軟件，激發光波長分別為340 nm及380 nm，發射光波長為505 nm，采樣間隙為300ms。每次選取10個細胞，測量心肌細胞［Ca2+］i的瞬間變化，連續記錄心肌細胞在給藥前后的熒光強度。根據文獻［4］方法計算心肌細胞［Ca2+］i，計算［Ca2+］i前應減去細胞自身的熒光。

1.7 統計學處理

數據均采用 SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差(±s)表示，2組間比較采用兩樣本均數的t檢驗，多組間均數比較采用方差分析。以 P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有非常顯著性。

2 結果

2.1 Pue對心肌細胞存活率的影響

表1顯示，與空白組相比，HG組的細胞存活率降低了36.6%，差異極顯著(P＜0.01);與高糖組相比，HG+10－3mol/L Pue組和 HG+2 × l0－3mol/L Pue組分別增加了46.2%和53.8%，差異具有統計學意義。

2.2 Pue對心肌細胞NO和 ET的影響

表2顯示，HG組細胞的NO水平較對照組降低38.24%，ET水平則升高27.4%，差異極顯著(P＜0.01);Pue 2個治療組較 HG組的2項指標有顯著性改善，其中 2×l0－3mol/LPue組效果更好，與HG組的差異也最顯著(P＜0.01)。

表1 Pue對HG誘導的乳大鼠心肌細胞存活率的影響(±s)

表1 Pue對HG誘導的乳大鼠心肌細胞存活率的影響(±s)

注:與正常對照組比較:＊＊P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別A570 0.82 ±0.03 HG(2 5 mmol/L)組 0.52 ±0.02＊＊HG +1 0 －3mol/LPue 組 0.77 ±0.03△HG+2 × l0－3mol/LPue組 0.80 ±0.02空白組△△

表2 Pue對HG誘導心肌細胞NO和ET的影響(±s)

表2 Pue對HG誘導心肌細胞NO和ET的影響(±s)

注:與正常對照組比較:＊＊P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別 NO(μmol/L)ET(μmol/L)68.35 ±9.35 4.83 ±0.64 HG(2 5 mmol/L)組 42.21 ±7.34＊＊ 6.15 ±0.86＊＊HG +1 0－3mol/LPue 組 59.84 ±8.66△ 5.24 ±0.72△HG+2 × l0－3mol/LPue組 64.62±7.51△△ 4.98±0.61空白組△△

2.3 Pue對心肌細胞Ca2+的影響

表3顯示，HG組心肌細胞［Ca2+］i變化的基線水平與空白組接近，但［Ca2+］i瞬間變化幅度明顯增高，頻率顯著性加快(P＜0.01)。Pue 2個劑量組均能降低顯著性HG誘導的心肌細胞鈣離子瞬間變化，其中在變化幅度上2×l0－3mol/LPue組改善效果更好。

表3 Pue對HG誘導心肌細胞［Ca2+］i瞬間變化的影響(±s)

表3 Pue對HG誘導心肌細胞［Ca2+］i瞬間變化的影響(±s)

注:與正常對照組比較:＊＊P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別 ［Ca2+］i/nmol·L －1 f/min峰值 靜息182±12 102±8 48±3.1 HG(2 5 mmol/L)組 298±14＊＊ 103±8 76±4.5＊＊HG+1 0－3mol/LPue組 244±13△ 104±6 52±3.6△△HG+2×l0－3mol/LPue組 194±12△△ 103±7 51±2.9空白組△△

3 討論

ET是一種很強的縮血管活性肽，由心肌細胞和成纖維細胞合成并分泌。體內外研究表明，ET既可以促進心肌細胞和血管平滑肌合成釋放AngⅡ，又是醛固酮合成和釋放的強效調節劑。ET及其受體的表達也與糖尿病大鼠心肌纖維化有關，高血糖可引起內皮素受體上調，應用ET受體拮抗劑可對抗高糖下心肌缺血再灌注引起的心肌細胞損傷［5］。NO是內皮細胞合成和分泌的一種內源性調節因子，它有許多血管生理調節功能，如舒張血管、降低血壓;維持血管內膜表面無血栓形成，抑制血管平滑肌細胞增殖，維持其正常的有絲分裂;維持正常的心肌收縮功能及心輸出量等。有報道顯示［6、7］，高糖可引起內皮細胞NO合成減少，血液中NO濃度降低，血管平滑肌NO/cGMP通路反應異常。

本實驗結果顯示，在低血清培養環境下，HG會使培養心肌細胞存活率和NO濃度下降，ET水平增加;應用Pue干預的2組可以使高糖環境的心肌細胞在上述指標方面產生明顯改善，即細胞存活率和NO含量較 HG升高，ET水平下降，且2×10－3mol/LPue組效果更好。這說明Pue可以通過影響心肌細胞相關因子水平抑制高糖產生的不良影響。

Ca2+是心肌細胞最重要的信號分子之一，生理狀態下主要參與心肌細胞的機械做功和能量代謝。大量實驗表明，Ca2+作為一個細胞信號傳導過程中的主要信使，介導了糖尿病心肌肥大的形成和發展［8、9］。心肌細胞內 Ca2+超載是糖尿病性心肌病的發病原因之一。ET可增加心肌細胞和成纖維細胞的有絲分裂，直接引起心肌細胞鈣超載［10］。李菊香研究發現，Pue能抑制外源性氧化型低密度脂蛋白培養的臍靜脈內皮細胞產生一氧化氮合酶(NOS)抑制物，使NO合成增加，ET減少，細胞內［Ca2+］i下降，從而改善內皮細胞功能［11］。本次實驗結果可見，HG組與空白組相比心肌細胞鈣離子的峰幅度顯著升高(P＜0.01)，頻率明顯加快(P＜0.01);Pue 2個治療組可以顯著改善高糖環境心肌細胞的上述指標，而且結果仍提示2×l0－3mol/LPue組的效果更好。

綜上所述，本實驗證實Pue能夠有效地干預高糖誘導的心肌細胞因子的改變和鈣超載，提示這可能是葛根素抑制高糖誘導心肌細胞損傷發生的保護機制之一。

［1］Xie RQ，Du J，Hao YM.Myocardial protection and mechanism of Puerarin Injection on patients of coronary heart disease with ischemia/reperfusion［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2003，23(12):895-897.

［2］呂欣然，高 爾，許蘭芝.葛根素對含 β-腎上腺受體的離體器官和整體動物的阻斷作用［J］.中國藥理學報，1986;7(6):537-539.

［3］張 玲，王洪新，高俊虹，等.葛根素對異丙腎上腺素致大鼠心肌肥厚心肌膠原及細胞內鈣離子的影響［J］.中成藥，2008，30(8):1220-1222.

［4］Chen S，Khan ZA，Karmazyn M，et al.Role ofendothelin-1，sodium hydrogen exchanger-1 andmitogen activated protein kinase(MAPK)activation in glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.DiabetesMetab Res Ren，2007，23(5):356-367.

［5］Subodh Verma， Andrew Maitland， Richard D， et al.Hyperglycemia exaggerates ischemia-reperfusion-induced cardiomyocyte injury:Reversal with endothelin antagonism［J］.Thoracic and Cardiovascular Surgery，2002，123(6):1120-1124.

［6］Tesfamariam B.Free radicalsin diabetic endothe-lialcell dysfunction［J］.Free Radic Biol Med，1994，16:383.

［7］Pieper Gm，Mei DA，Langenstroer P，et al.Bioassay of endothelium-derived relaxing factor in diabetic rat aorta［J］.Am J Physiol，1992，263:676.

［8］Jorn op den Buijs，Zsuzsanna Mikols，Natal A.W.van Riel，et al.β-Adrenergic activation reveals impaired cardiac calcium handing at early stage of diabetes［J］.Life Sciences，2005，76(10):1083-1098.

［9］Natale Rolim，Tomas Stolen，Charlotte B，et al.Aerobic interval training prevents cardiac dysfunction and mortality by improving calcium handing in MI diabetic mice［J］.Biophysical Journal，2010，98(3):101a.

［10］Jennings G，Wong J.Regression of left ventricular hypertrophy in hypertension:changing patterns with successice meta-analyses［J］.J Hypertens，1998 16(suppl 6):S29-S34.

［11］李菊香，羅 偉，汪進益，等.葛根素對ox-LDL培養血管內皮細胞內圓形一氧化氮合酶抑制物代謝的研究［J］.中國藥科大學學報，2004，35(4):353-356.