淫羊霍苷對去卵巢骨質疏松癥雌鼠的療效及機理初步研究＊

劉仕杰，莫新民△，李勁平，楊 軍，張小君

(1.湖南中醫藥大學，長沙 410007;2.中南大學藥學院，長沙 410013)

壯骨止痛方是本課題組開發的治療骨質疏松癥的新藥，對絕經后骨質疏松癥有良好療效［1］。課題組在確定復方有效部位的基礎上［2］，從其無水乙醇部位分離制備了淫羊霍苷，通過藥效學試驗證明淫羊霍苷是其有效成分之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與飼料 3月齡SD雌性大鼠40只，體重250g左右，SPF級。飼料為標準普通飼料。動物和飼料均由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供(動物許可證號SCXK(湘)2009-0004)。

1.1.2 藥品與試劑 壯骨止痛方(原材料購自九芝堂，由中南大學藥學院制備)，淫羊霍苷(由中南大學藥學院制備，純度99.99%)，雌激素(HY-032)放免試劑盒(北京華英生物技術研究所)。

1.1.3 主要儀器 Unigamma骨密度儀(意大利)，JY3002型電子天平，低溫離心機，LEICA DM LB2型雙目顯微鏡，超低溫冰箱，WDW-1000Ⅲ微機控制電子式萬能實驗機，MIAS醫學圖像分析系統，Motic B5顯微攝像系統和GC-1500r放射免疫計數器等。

1.2 方法

1.2.1 分組 大鼠適應性飼養1周，按體重隨機分為假手術組10只，其他30只大鼠造模，術后1周將模型大鼠按體重隨機分為模型組、壯骨止痛方組和淫羊霍苷組，共4組。

1.2.2 造模方法［3］采用公認的成年雌性大鼠去卵巢3個月絕經后骨質疏松癥病理模型。造模方法:2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g體重)麻醉，在無菌的條件下從距離大鼠胸腰椎外側1cm處縱向切開皮膚及兩側肌肉，摘除雙側卵巢，假手術組僅在卵巢周圍切除相應體積的脂肪，分兩層縫合傷口并用生理鹽水擦洗干凈血跡，術后連續3d大腿肌肉注射青霉素鈉，每只大鼠4萬u/d，術后5d拆線，飼養于室溫23℃ ～25℃、相對濕40% ～60%的清潔環境中，自由攝食和攝水。

1.2.3 給藥方法 各組均從拆線后開始給藥，每天灌胃1次，連續13周。假手術組和模型組每天灌胃相應體積的冷開水和油中王牌植物油，壯骨止痛方組灌藥(水相 0.25ml/100g·d，油相 0.75ml/100g·d)，淫羊霍苷組灌藥(水相0.4ml/100g·d，油相0.6ml/100g·d)。劑量按各藥效相關物質相對壯骨止痛方的得率及人鼠體表面積折算確定。

1.2.4 指標檢測 連續灌胃13周，每10d稱1次體重，13周之后所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)，麻醉后腹部切口分離腹主動脈，用負壓采血管血 8ml，靜置 2h ～3h，3000r/min 離心15min后分離血清，以備放射免疫法檢測相關指標。剖取左右后肢完整的脛骨及第2～4腰椎，去除上面附著的肌肉組織保留骨膜并做相關檢查。

血清E2檢測:(1)放射免疫法檢測血清 E2;(2)骨密度檢測:取第2～4腰椎骨用濕紗布包裹，送湖南中醫藥大學附一院骨密度室檢測骨密度;(3)骨生物力學檢測:取右脛骨分干凈肌肉，用濕紗布包裹送國防科技大學物理系檢測骨最大抗彎曲強度;(4)骨組織病理學檢測:取左側脛骨用4%的多聚甲醛固定48h，然后用5%的硝酸脫鈣1周，送湖南中醫藥大學病理檢驗中心檢測脛骨的病理組織學形態變化，測量平均骨小梁密度。

1.2.5 統計方法 數據處理采用SPSS16.0統計軟件進行方差分析和Q檢驗，實驗數據以平均值±標準差(±s)表示，P＜0.05具有顯著性差異。

2 結果

2.1 對去卵巢雌性骨質疏松模型大鼠血清E2的影響

表1 對去勢骨質疏松大鼠血清E2的影響

表1顯示，淫羊藿苷組與模型組相比明顯升高，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。

2.2 對去卵巢雌性骨質疏松模型大鼠骨密度的影響

表2 對去勢骨質疏松大鼠骨密度的影響

表2顯示，淫羊霍苷組腰椎骨密度與模型組相比明顯升高，差異有顯著性意義(P＜0.05)，與壯骨止痛方組比較無顯著差異性(P＞0.05)。

2.3 對去卵巢雌性骨質疏松模型大鼠右脛骨骨生物力學的影響

表3 對去勢大鼠骨生物力學的影響

表3顯示，與模型組相比，淫羊霍苷組有提高右脛骨最大抗彎曲強度的趨勢，但無差異性(P＞0.05)。壯骨止痛方組能夠顯著提高右脛骨的最大抗彎曲強度(P＜0.01)，提高骨生物力學性能。

2.4 對去卵巢雌性骨質疏松癥大鼠左脛骨骨組織形態學的影響

表4 對去勢大鼠左脛骨骨小梁密度的影響

表4顯示，在10×40倍鏡下，通過顯微形態學計算機網絡系統測量骨小梁的密度，每張切片取5個視野，取其平均值。

病理切片表明，假手術組骨小梁分布均勻，股骨頸梁髓比正常。去卵巢模型組骨小梁稀疏、破壞，髓腔擴大，梁髓比下降，說明壯骨止痛方組和淫羊霍苷組能提高骨小梁的分布和梁髓比。

圖1 大鼠左脛骨骨組織病理切片

3 討論

絕經后骨質疏松癥屬于高代謝轉換型，即破骨細胞的骨吸收活動增強，骨吸收大于骨形成，因此絕經后骨質疏松癥發病機制的中心環節是破骨細胞數量的增加。淫羊藿苷是淫羊藿中含量最為豐富的黃酮苷類化合物，大量實驗表明，淫羊藿苷具有抑制破骨細胞活性、增強成骨細胞活性的作用。有研究表明［4］，淫羊藿苷可明顯改善骨質疏松模型小鼠的骨形態計量學指標。實驗證明［5］，通過采用MTT法做淫羊藿苷對離體人成骨細胞增殖的研究發現，不同濃度的淫羊藿苷對成骨細胞的生長增殖均有促進作用，從而得出結論淫羊藿苷在促進成骨細胞增殖的同時，增強了成骨細胞成骨活性。

本實驗中，模型組和假手術組相比較，血清E2和腰椎骨密度明顯下降，差異有顯著性(P＜0.05)，骨小梁稀疏、破壞，髓腔擴大，梁髓比明顯下降，差異顯著(P＜0.05)，右脛所能承受的最大壓力下降，差異顯著(P＜0.05)，說明大鼠去卵巢后不僅有骨量的減少，還有骨強度的下降，這些特征與絕經后骨質疏松的生理改變類似，說明本實驗中的病理模型復制成功。

給藥后與模型組相比，淫羊霍苷組血清E2增高和骨密度增加明顯(P＜0.05)，骨小梁密度顯著提高(P＜0.05)，提高了骨小梁的分布和梁髓比，說明淫羊霍苷能有效地抑制去勢后骨量的丟失。骨生物力學性能未見顯著提高(P＞0.05)，但從結果分析有提高的趨勢，說明淫羊藿甘對絕經后骨質疏松具有良好的療效。

雌激素的減少可導致相應的免疫功能自穩平衡被破壞，激活和增殖T細胞，促進破骨細胞的形成。雌激素缺乏時，巨噬細胞集落刺激因子、破骨細胞分化因子表達增加，T細胞增多，腫瘤壞死因子、白介素1產生增多，破骨細胞分化增殖增多，生存期延長，骨吸收增強，同時成骨細胞凋亡增多，骨形成不足以代償骨吸收，使骨量減少，骨小梁變細，小梁間隙增寬，發生骨質疏松［6］。胸腺缺如的T細胞缺乏的小鼠與正常小鼠比較，去卵巢術后(ovariectomy，OVX)不伴有破骨細胞的增加，胸腺缺如對OVX誘導的骨量減少和骨轉換指標的增加有保護作用。TNF-α-/-的OVX小鼠不發生骨量減少，而將野生型小鼠的T細胞移植給胸腺缺如的小鼠可恢復OVX誘導的骨量減少，但自 TNF-α-/-小鼠移植的 T細胞則不能恢復OVX誘導的骨量減少，提示T細胞介導了雌激素缺乏對破骨細胞的刺激作用以及對骨重建的作用［7］，這說明雌激素缺乏所導致的骨質疏松癥是通過T細胞來發揮作用的，T細胞對破骨細胞的形成具有主導作用。

本實驗提示，淫羊霍苷具有明顯提高血清E2的含量，具有差異性(P＜0.05)，其治療絕經后骨質疏松癥的作用機制可能是通過調節體內雌激素水平，從而調節巨噬細胞向破骨細胞的轉化而發揮作用，具體過程還有待更進一步的研究。

［1］莫新民，曾 英，彭瓊輝，等.壯骨止痛膠囊治療去卵巢雌鼠骨質疏松癥療效的實驗研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2007，13(3):195-198.

［2］甘國興，莫新民，李勁平，等.壯骨止痛方藥效部位的篩選及其對骨質疏松雌鼠骨代謝相關激素的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(15):126-130.

［3］魏玉芳，王長海，劉鈺林，等.補腎法對大鼠絕經后骨質疏松模型的影響［J］.第四軍醫大學學報，2007，28(6):544-545.

［4］張金娟，文 娛，張貴林，等.淫羊藿苷對骨質疏松模型小鼠骨組織形態計量學指標的影響［J］.貴州醫藥，2010，34(5):404-405.

［5］于 波，楊久山，劉 巖，等.淫羊藿苷對人成骨細胞的作用［J］.中醫正骨，2006，18(6):17-18.

［6］邢小平，王 鷗，韓桂艷.代謝性骨病與免疫［J］.臨床內科雜志，2007，24(3):149-152.

［7］Cenci S，Weitzmann MN，Roggia C，et al.Estrogen deficiency induces bone loss by enhanceing Tcell production of TNF-α［J］.J Clin Invest，2000，106:1229-1237.